哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)主要分布于海洋环境和海洋生物体中,是多种海洋鱼类和无脊椎动物的条件致病菌。弧菌病的防治主要依赖于抗生素和化学药物,喹诺酮类药物在水产养殖业中应用广泛,水产养殖环境中的细菌对此类药物的耐药性日趋显著。目前,缺乏哈维氏弧菌对于喹诺酮药物耐药机制的相关研究。本研究以哈维氏弧菌标准菌株ATCC33843和临床分离的敏感菌株为研究对象,在含亚抑菌浓度诺氟沙星的培养基上进行逐步诱导,分别对诱导前后菌株耐药性和生物学特性进行检测。结果成功筛选了两株高水平喹诺酮耐药菌株(MIC为512~1024?g/ml),耐药性能稳定遗传并且呈现交叉耐药现象。耐药株与敏感株相比泳动能力和生物膜形成能力均显著上升,生长曲线无明显变化。利用PCR扩增和基因测序的方法检测各诱导菌株靶基因gyr A、gyr B、par C、par E的喹诺酮耐药决定区(QRDR),并加入外排泵抑制剂(CCCP)抑制细菌主动外排系统,测定不同药物对细菌的MIC。结果显示随着诱导菌株MIC值的不断增加,靶基因上逐渐产生了突变,先是gyr A第83位Ser发生单点突变为Ile,之后par C基因上的第85位Ser突变为Tyr或Phe,gyr B和par E未检测到突变。加入CCCP后,耐药菌的MIC值均有所下降。提示哈维氏弧菌对喹诺酮类耐药可能存在靶基因突变及外排泵等多种耐药机制。通过RNA-seq技术对临床分离的哈维氏弧菌的敏感菌株(VS)和耐药株(VR)同时进行转录组测序,经从头拼接(De nove)再组装共得到2,082条Unigene。通过比对,两个样品共鉴定出129个差异表达基因,耐药菌与敏感菌相比有65个基因上调,64个下调。对这些差异表达基因进行功能注释和富集分析,发现双组份系统(ko02020)、ABC转运系统(ko02010)、鞭毛组装(ko02040)通路显著富集,并找到与喹诺酮耐药相关的9个基因。转录组数据揭示哈维氏弧菌的耐药机制除了经典的靶位点突变外,主动外排系统、双组份系统与鞭毛组装等调节机制也参与耐药的形成。利用RT-PCR技术在优化的荧光定量PCR的反应条件下对10个差异表达基因的表达量进行相对定量分析,结果与转录组分析的基因表达趋势基本一致,证实了转录组测序和数据分析的可靠性。对预测的哈维氏弧菌喹诺酮耐药基因qnr进行克隆和原核表达优化,结果表明哈维氏弧菌qnr全长651bp,编码216个氨基酸;重组蛋白优化条件为28℃、IPTG浓度为0.05 mmol/L条件下诱导6 h。获得的哈维氏弧菌QNR蛋白为下一步蛋白的纯化,进一步研究其结构和功能以及细菌的耐药机制奠定基础。