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金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxins,SEs)是金黄色葡萄球菌产生的一种外毒素,为水溶性的蛋白质,可引起食物中毒,由于其免疫激活作用极其强大,White等人将其定义为超抗原。此种超抗原与普通异种抗原不同,它不需要经过抗原递呈细胞(APC)的处理,在主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子的作用下,只需极小剂量(10-12mol/L)就可以刺激比普通抗原多数千倍的Vβ特异性T细胞增殖,并释放大量细胞因子,是一种较好的免疫调节剂和增效剂,近年来被广泛用于肿瘤治疗的研究。根据血清型的不同将金黄色葡萄球菌的肠毒素主要分为SEA,SEB,SEC1,SEC2,SEC3,SED,SEE七种类型,其中SEA是最常见的一种。SEs对肿瘤细胞的杀伤作用主要表现在两个方面。一是SE活化的CD4+的辅助性/杀伤性(helper/killer)T细胞和CD8+的抑制性(suppressor)/细胞毒性T细胞(cytotoxiclymphocytes,CTLs),通过形成TCRVβ-SE-MHCⅡ类分子复合物,直接杀伤表达MHCⅡ类分子的肿瘤细胞,称为SE依赖的细胞介导的细胞毒作用(SE-dependentcell-mediatedcytotoxity,SDCC)。对不表达MHCⅡ类分子的肿瘤细胞也产生间接的效应。二是通过SE活化的T细胞分泌的细胞因子发挥抑瘤作用,如INF-γTNF-αTNF-βIL-1αIL-1βIL-2IL-6和IL-12等。本研究利用现代分子生物学实验技术,通过对超抗原SEA,SEB及bFGF-SEB融合蛋白基因的克隆,表达,纯化和体外抑瘤活性的基础性研究,为超抗原抑瘤机理、超抗原类抗癌药物和疫苗的开发利用奠定基础。
本研究应用PCR技术,从金黄色葡萄球菌肠毒素基因组中扩增出SEA,SEB基因片段,将其克隆后测序得到长度为740bp左右的基因片段(SEA和SEB的基因片段长度大致相同)。经序列分析与GenBank中的基因序列一致。将SEA,SEB基因片段插入到高表达载体PET-30a上,得到重组质粒PET-30a-SEA和PET-30a-SEB。经IPTG诱导表达得到两个分子量约为28KDa的重组蛋白表达带,表达量分别占菌体总蛋白的50%和40%。免疫印迹实验结果表明两个重组蛋白SEA,SEB都能够与相应兔抗SEA和兔抗SEB抗体结合发生抗原抗体反应,说明重组蛋白具有良好的免疫反应性和抗原特异性。表达产物经过金属离子鳌合亲和层析纯化,得到纯度为95%的重组蛋白。重组蛋白体外刺激小鼠脾细胞增殖实验中,通过与天然超抗原蛋白SEA对照和阴性对照对比,重组蛋白能够有力的刺激小鼠脾细胞的增殖,说明了重组蛋白具有与天然蛋白相似的超抗原活性。此外,为验证超抗原刺激脾细胞后细胞因子产生情况以及T淋巴细胞表型的变化,实验中还对此进行了相关检测,结果表明超抗原主要引起Th1型细胞因子的产生,如IL-2,IFN-γ,TFN-α,而Th2型细胞因子IL-4的产生量很少。从体内外细胞表型检测结果中可见,和阴性对照相比,超抗原刺激后能使CD4+T细胞和CD8+T细胞数量增加,后者的增加更明显一些。此结果正好与细胞因子检测结果相符合,说明超抗原能够充分激活T淋巴细胞并分泌细胞因子发挥一定的抗肿瘤作用。体外肿瘤细胞生长抑制实验再次证明了超抗原的活性,能够在一定程度上抑制肿瘤细胞的生长。
另外,实验中还通过选用成纤维细胞生长因子(bFGF)受体FGFR作为肿瘤细胞的靶向位点,利用分子生物学实验技术构建了金黄色葡萄球菌肠毒素B与人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的融合表达载体PET-30a-SEB-bFGF,经IPTG诱导表达出分子量约44KDa的重组融合蛋白,占茵体总蛋白的30%左右。在该融合蛋白的活性检测中,可见具有与超抗原SEA,SEB相似的刺激脾细胞增殖活性,细胞因子的产生和T淋巴细胞表型的改变以及体外抑制肿瘤细胞生长的作用,这都说明SEB与bFGF融合后仍保留了SEB的超抗原活性。实验中还通过免疫荧光法检测了bFGF的靶向作用,初步达到实验设计的预期效果,肿瘤细胞周围蛋白聚集量较阴性对照多,荧光信号强。这将为后续融合蛋白抗肿瘤效应的研究奠定良好基础。
通过本课题的研究,将为超抗原的肿瘤治疗及超抗原靶向治疗肿瘤方面的研究提供一条新的思路和方法,也为超抗原抑瘤机理、超抗原类抗癌药物和疫苗的开发利用起到了推陈出新的作用。