本文从以下几个部分展开论述：　　第一部分：tmTNF-α双向信号促进T细胞AICD的作用及机制研究　　本课题利用人原代T细胞AICD模型观察并验证上述前期研究的效应，进而分别阻断 tmTNF-a表达和 tmTNF-a高表达，以观察tmTNF-a对T细胞AICD的影响；分别沉默FasL和TRAIL，观察tmTNF-α反向信号是否通过上调FasL/Fas，TRAIL/DR4/5促进AICD；同时设计杀伤实验，观察tmTNF-α反向信号是否通过上调TNFR1/TNFR2的表达，增强活化T细胞对两型TNF-α诱导的杀伤敏感性，从而促进AICD。主要结果如下：　　一.在活化T细胞AICD模型中，tmTNF-α的表达显著增高　　1.人原代T细胞AICD模型的建立　　将新鲜分离的人原代T细胞，即静息T细胞，经过5μg/ml PHA刺激3天后，在含有50 U/ml IL-2的RPMI-1640完全培养基中，继续培养7天，成为预活化T细胞。将预活化T细胞，经10μg/mlαCD3抗体(OKT3)刺激24 h，诱导活化T细胞凋亡。凋亡结果显示：静息T细胞的凋亡率为0.9%，预活化T细胞的凋亡率为18.0%，而经过αCD3诱导之后的活化T细胞则发生明显的凋亡，凋亡率为62.3%，说明已成功建立人原代T细胞AICD模型。　　2.在活化T细胞AICD模型中，tmTNF-α的表达显著增加　　在活化T细胞AICD模型中，流式结果显示：静息T细胞、预活化T细胞和活化T细胞的tmTNF-α表达率分别为1.46%、23.9%和60.1%。上述结果表明：在人原代T细胞AICD中，tmTNF-α表达率在活化T细胞中显著增加，且与T细胞凋亡率的增加同步，提示tmTNF-α可能参与T细胞AICD。　　二. tmTNF-α参与T细胞AICD　　1.下调tmTNF-α的表达可抑制T细胞AICD　　在人原代T细胞AICD模型中，转染TNF-α AS沉默TNF-α，降低tmTNF-α的表达，与αCD3组相比，αCD3+TNF-α AS组T细胞的tmTNF-α表达率(p＜0.05)和凋亡率(p＜0.05)均显著降低。　　2.上调tmTNF-α的表达可促进T细胞AICD　　在人原代T细胞AICD模型中，给予TAPI-1（TACE抑制剂）处理，抑制TACE活性，阻止tmTNF-α被水解为sTNF-α，上调tmTNF-α表达(p＜0.001)，αCD3诱导T细胞凋亡率显著增加(p＜0.01)。　　三. sTNF-α参与T细胞AICD　　1.在T细胞AICD中，sTNF-α分泌增加　　在原代T细胞和Jurkat细胞AICD模型中，分别经αCD3和PHA诱导凋亡， sTNF-α在活化T细胞培养上清中的浓度显著增加，且与T细胞凋亡率的增加同步。　　2.外源性sTNF-α可促进T细胞AICD　　在原代T细胞AICD模型中，sTNF-α不能直接诱导T细胞凋亡，然而，与αCD3组相比，αCD3+sTNF-α组T细胞凋亡率显著增加，提示外源性sTNF-α促进活化T细胞凋亡。　　四. tmTNF-α反向信号可促进T细胞AICD　　在原代T细胞AICD模型中，用TNF-α pAb激活tmTNF-α反向信号，与Control组相比，单独TNF-α pAb组T细胞凋亡率未见明显变化；而与αCD3组相比，αCD3+TNF-α pAb组T细胞凋亡率(76.7%)显著高于αCD3组(60.9%)(p＜0.01)，提示tmTNF-α反向信号可促进αCD3诱导的T细胞凋亡。　　五. tmTNF-α反向信号可通过上调FasL/Fas和TRAIL/DR4促进AICD　　1. tmTNF-α反向信号通过上调FasL/Fas促进AICD　　2. tmTNF-α反向信号通过上调TRAIL/DR4促进AICD　　六. tmTNF-α反向信号通过上调TNFR1和TNFR2增强活化T细胞对两型TNF-α的敏感性　　1. tmTNF-α反向信号可上调活化T细胞中的tmTNF-α表达　　在原代T细胞AICD模型中，与αCD3组(67.7%)相比，αCD3+TNF-α pAb组T细胞的tmTNF-α表达率显著升高(84.2%)，p＜0.05。上述结果提示，tmTNF-α反向信号可上调tmTNF-α的表达。　　2. tmTNF-α反向信号可上调活化T细胞中TNFR1和TNFR2的表达　　在原代T细胞AICD模型中，与αCD3组相比，αCD3+TNF-α pAb组T细胞的TNFR1(55.2%，p＜0.05)和TNFR2(69.1%，p＜0.05)的表达率显著升高，上述结果提示tmTNF-α反向信号可上调活化T细胞中TNFR1和TNFR2的表达。　　3. tmTNF-α反向信号通过上调TNFR1增强活化T细胞对sTNF-α诱导AICD的敏感性　　4. tmTNF-α反向信号通过上调TNFR2增强活化T细胞对tmTNF-α诱导AICD的敏感性　　结论：我们以上结果证明了tmTNF-α在活化T细胞的表达显著增加，（1） tmTNF-α作为配体，通过TNFR2直接介导T细胞的凋亡；（2）tmTNF-α作为受体，其反向信号通过上调TNFR1增强活化T细胞对sTNF-α诱导AICD的敏感性，通过上调TNFR2增强活化T细胞对tmTNF-α诱导AICD的敏感性；（3） tmTNF-α作为受体，其反向信号可通过上调FasL/Fas和TRAIL/DR4促进AICD。本课题旨在阐明两型TNF-α正向信号及tmTNF-α的反向信号在AICD中的生物学作用及其分子机制，为临床治疗自身免疫病提供新的线索。　　第二部分：tmTNF-α反向信号抵抗内毒素休克的作用及其机制研究　　本研究利用人单核细胞系THP1细胞（高表达tmTNF-α）经PMA诱导，分化为成熟的巨噬细胞，建立体外内毒素休克细胞模型。分别利用 Infliximab与D4476（CKI抑制剂）激活tmTNF-α反向信号，LB100（PP2A抑制剂）抑制tmTNF-α反向信号，进一步验证tmTNF-α反向信号LPS诱导促炎因子产生的影响，并初步研究tmTNF-α反向信号对LPS诱导NF-κB信号通路的影响。本论文旨在初步探索 tmTNF-α反向信号抵抗 LPS的分子机制，以期阐明 tmTNF-α反向信号及TNF-α拮抗剂在内毒素休克和炎症性疾病中的作用及其机制，为其临床治疗提供实验依据和线索。　　一. tmTNF-α反向信号可抑制LPS诱导的促炎因子的产生　　1. Infliximab激活的tmTNF-α反向信号可抑制LPS诱导产生促炎因子　　Infliximab是一种商品化的人TNF-α单克隆抗体，可激活tmTNF-α反向信号。Infliximab预孵育30 min，再用LPS分别刺激THP1细胞，结果显示：Infliximab激活的tmTNF-α反向信号可抑制LPS诱导的IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA水平及上清中IL-1β和IL-6的含量。　　2. D4476抑制tmTNF-α磷酸化而促进其反向信号，可抑制LPS诱导产生促炎因子　　D4476是一种CKI抑制剂，可抑制tmTNF-α胞浆段磷酸化，而活化反向信号。D4476预孵育30 min，再用LPS刺激THP1细胞，结果显示：D4476激活的tmTNF-α反向信号可抑制LPS诱导的IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA水平及上清中IL-1β和IL-6的含量。　　3. LB100阻断tmTNF-α脱磷酸化而抑制其反向信号，可促进LPS诱导产生促炎因子　　LB100可全完阻断Infliximab抑制LPS诱导的IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA水平及上清中IL-1β和IL-6的含量。提示，LB100可完全阻断Infliximab诱导的tmTNF-α反向信号介导的负调作用，但Infliximab对于LB100的作用则无作用。　　4. Infliximab激活的tmTNF-α反向信号对LPS诱导产生抑炎因子无影响　　Infliximab预孵育30 min，再用LPS刺激THP1细胞，结果显示：Infliximab激活的tmTNF-α反向信号对LPS诱导的IL-10和TGF-β的mRNA水平无影响。二. tmTNF-α反向信号抵抗内毒素休克的分子机制——tmTNF-α反向信号可能通过上调A20的表达而抑制LPS诱导的NF-κB活化　　根据文献报道，负调分子A20、IRAK-M、SHIP-1、SOCS-1和SOCS-3参与内毒素耐受，可有效抑制LPS诱导的NF-κB活化。Infliximab预孵育30 min，再用LPS刺激THP1细胞4 h，结果显示：与LPS组相比，LPS+Infliximab组可显著增加A20的mRNA水平，对其他分子无明显影响。提示tmTNF-α反向信号可能通过上调A20的表达抑制LPS诱导的NF-κB活化。综上所述：tmTNF-α通过其反向信号抑制LPS诱导促炎介质的产生，其分子机制是通过上调A20抑制LPS诱导的NF-κB活化。本研究初步结果揭示tmTNF-α反向信号抵抗LPS的分子机制，为TNF-α拮抗剂在内毒素休克和炎性疾病中的作用及其临床治疗提供实验依据和线索。