论文部分内容阅读
目的格列本脲(Glyburide)是治疗2型糖尿病最普遍的药物之一,同时也是经典的NLRP3炎性体抑制剂。越来越多的证据表明格列本脲能够降低癌症发生风险和抑制肿瘤生长,并且有研究报道格列本脲可以抑制肺癌细胞的增殖和迁移,但是格列本脲在苯并(a)芘[Benzo(a)pyrene,B(a)P]联合细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠炎症相关肺癌中的作用及其机制还不清楚。在本研究中建立了持续给予格列本脲干预的炎症相关肺癌小鼠模型,探索格列本脲是否能抑制小鼠肺部肿瘤的发生和其机制,为预防和治疗炎性相关肺癌的发生提供线索。方法1.SPF级的野生C57BL/6小鼠随机分为6组:三辛酸甘油酯联合生理盐水组(Vehicle control,n=16),苯并芘联合脂多糖组(B(a)P+LPS,n=30),持续给予(0.48mg/kg)格列本脲的三辛酸甘油酯组(Tricaprylin+Gly(0.48mg/kg),n=19),持续给予(0.48mg/kg)格列本脲的苯并芘联合脂多糖组(B(a)P/LPS+Gly(0.48mg/kg),n=31),持续给予(0.96mg/kg)格列本脲的三辛酸甘油酯组(Tricaprylin+Gly(0.96mg/kg),n=16),持续给予(0.96mg/kg)格列本脲的苯并芘联合脂多糖组(B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg),n=34)。B(a)P+LPS组小鼠经气管滴注B(a)P(lmg/mouse,溶于50μl的三辛酸甘油酯)或50μl的三辛酸甘油酯,每周1次,连续4次后停止,此时计为第0周,3周后小鼠经气管滴注LPS(2.5μg/mouse,溶于50μl的生理盐水)或50μl的生理盐水,每三周1次,连续给予5次。需要给予格列本脲组的小鼠于B(a)P开始给予前一周分别开始经口灌胃(灌胃体积按小鼠体重10μl/g计算)0.48mg/kg或0.96mg/kg的格列本脲,每周3次直至动物模型结束。2.从动物模型开始到结束大约每月一次对给予格列本脲的小鼠进行血糖检测,并于第190天比较各组小鼠的平均体重增量。正常饲养至22周作为动物模型第一阶段,剩下的小鼠正常饲养至30周作为动物模型第二阶段,宰杀小鼠取出肺组织称重并观察肺部成瘤情况,计数成瘤小鼠肺部肿瘤数,并计算肺部成瘤率。取每只小鼠左侧肺叶浸泡于4%多聚甲醛中HE染色观察肺组织病理改变。3.免疫组化法检测小鼠肺组织中NLRP3、IL-1 β和IL-18蛋白的表达,Western blotting检测小鼠肺组织中IL-1β成熟蛋白体表达。结果1.小鼠正常饲养至22周后取出肺组织,观察肺表面成瘤情况,结果发现Vehicle control 组、Tricaprylin+Gly(0.48mg/kg)组和 Tricaprylin+Gly(0.96mg/kg)组小鼠未发现肉眼可见的瘤体,B(a)P+LPS组、B(a)P/LPS+Gly(0.48mg/kg)组和B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组小鼠均可观察到肉眼可见的瘤体。B(a)P+LPS组小鼠肺部成瘤率为 40%,B(a)P/LPS+Gly(0.48mg/kg)组和 B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组的成瘤率分别为37.5%和70%,各组肺部成瘤率差异无统计学意义。B(a)P+LPS组小鼠的平均成瘤数(2.5±1.77)高于B(a)P/LPS+Gly(0.48mg/kg)组(1.88±1.34),但是低于B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组小鼠的平均成瘤数(3.3±0.87),且各组肺部平均成瘤数差异无统计学意义。当剩余小鼠正常饲养至30周时,取出肺组织观察各组小鼠成瘤情况,Vehicle control 组、Tricaprylin+Gly(0.48mg/kg)组和Tricaprylin+Gly(0.96mg/kg)组仍未出现肉眼可见的瘤体,B(a)P+LPS组小鼠肺部成瘤率为89.4%,给予0.48mg/kg或0.96mg/kg的格列本脲后成瘤率降至82.6%和70.8%。与B(a)P+LPS组小鼠肺部平均成瘤数(5.58±1.04)相比,B(a)P/LPS+Gly(0.48mg/kg)组(3.22±0.63)和 B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组(2.13±0.42)小鼠肺部平均成瘤数都明显降低,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.第一阶段小鼠正常饲养至22周后,麻醉称重,取肺组织称重,计算各组脏器系数,肺脏系数在各组间差异无统计学意义,小鼠正常饲养至30周时发现B(a)P+LPS 组小鼠肺脏系数显著高于 Vehicle control 组(P<0.05),B(a)P+LPS 组小鼠给与0.96mg/kg格列本脲后肺脏系数明显降低(P<0.05)。给予0.48mg/kg和0.96mg/kg格列本脲组小鼠空腹血糖分别于动物建模第112天和第62开始与初始血糖相比显著降低(P<0.05),至动物模型结束小鼠空腹血糖都明显低于初始血糖值。给予0.48mg/kg或0.96mg/kg格列本脲后各组小鼠平均体重均缓慢增长,与Vehicle control 组平均体重增量比较,Tricaprylin+Gly(0.48mg/kg)组、Tricaprylin+Gly(0.96mg/kg)组都明显降低(P<0.05),且 Tricaprylin+Gly(0.96mg/kg)组平均体重增量显著小于Tricaprylin+Gly(0.48mg/kg)组;B(a)P+LPS组、B(a)P/LPS+Gly(0.48mg/kg)组和 B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组小鼠平均体重增量均小于 Vehicle control 组(P<0.05),且 B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组显著小于B(a)P+LPS 组和 B(a)P/LPS+Gly(0.48mg/kg)组(P<0.05)。3.第二阶段小鼠病理学检查发现与B(a)P+LPS组相比,B(a)P/LPS+Gly(0.48mg/kg)组和 B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组小鼠癌巢数目减少,给予格列本脲后肺部炎症明显改善。4.免疫组化结果显示,溶剂对照组、B(a)P/LPS+Gly(0.48mg/kg)组和B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组小鼠NLRP3和IL-1β蛋白表达均显著低于B(a)P+LPS 组,且 B(a)P+LPS 组与溶剂对照组、B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。IL-18蛋白的表达在B(a)P+LPS组B(a)P/LPS+Gly(0.48mg/kg)组和B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组间无明显差异;Western blotting 结果显示,与 Vehicle control 组比较,B(a)P+LPS 组 Cleaved-IL-1β表达量明显增加(P<0.05),与 B(a)P+LPS 组相比,B(a)P/LPS+Gly(0.96mg/kg)组Cleaved-IL-1β表达量显著降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论格列本脲可能通过抑制NLRP3炎性体减轻苯并(a)芘联合脂多糖诱导的小鼠炎性相关肺癌的发生。