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第一部分:组蛋白去乙酰化酶6抑制剂ACY-1215通过调控TLR4-MAPK/NF-kB信号通路抑制急性肝衰竭小鼠的炎症目的:组蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylase 6,HDAC6)被认为是一个治疗肿瘤、炎症及神经退行性病变的潜在靶点。作为一种高效的选择性HDAC6抑制剂,ACY-1215也被认为是一种潜在的抗炎及抗肿瘤药物。内毒素诱导的炎症反应引起肝脏损伤在急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)的发生发展中起着重要的作用。因此,本研究应用ACY-1215对ALF小鼠进行干预,探究其对ALF小鼠炎症的抑制作用及潜在机制。方法:用D-氨基半乳糖(400 mg/kg)联合脂多糖(100μg/kg)共同诱导ALF小鼠模型。将C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组以及ACY-1215组。ACY-1215组小鼠在造模前2小时预防性注射ACY-1215(25 mg/kg),其余两组注射等剂量生理盐水作为对照。造模后每隔6小时观察记录各组小鼠的死亡情况,并于造模后24小时处死动物取材。分别检测各组小鼠的肝功能、肝组织病理学改变、HDAC6及组蛋白H3、H4的乙酰化表达、炎症因子的表达、Toll-样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)及其下游丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核转录因子-κB(nuclear transcription factorκB,NF-κB)信号通路的表达情况。结果:与模型组相比,ACY-1215干预可显著降低ALF小鼠的死亡率,同时可改善ALF小鼠肝组织病理学改变和肝功能的损害。ACY-1215可特异性抑制ALF小鼠肝脏HDAC6蛋白及RNA的表达水平,还可显著降低ALF小鼠肝脏TNF-α、IL-1β等炎症因子的RNA表达水平。ACY-1215干预还可抑制ALF小鼠肝脏TLR4及其下游MAPK及NF-κB信号通路的活性。结论:选择性HDAC6抑制剂ACY-1215可通过调控TLR4-MAPK/NF-kB信号通路抑制炎性反应,对ALF小鼠起到保护作用。第二部分:组蛋白去乙酰化酶6抑制剂ACY-1215通过调控线粒体凋亡途径抑制急性肝衰竭的肝细胞坏死目的:急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是一种伴随大量肝细胞坏死和肝功能损害的临床综合征。作为一种选择性组蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylase 6,HDAC6)抑制剂,ACY-1215被认为是一种治疗炎症性疾病的潜在药物,但目前关于ACY-1215对ALF肝细胞坏死的影响尚不十分清楚。因此,本研究用ACY-1215干预ALF小鼠,观察其对ALF小鼠肝细胞坏死的影响并探讨其潜在的作用机制。方法:将C57/BL6小鼠随机分为对照组、模型组和ACY-1215组。用D-氨基半乳糖(400 mg/kg)联合联合脂多糖(100μg/kg)共同诱导小鼠ALF模型。ACY-1215组小鼠于造模前2小时行ACY-1215(25 mg/kg)预防性干预,其余两组注射等剂量生理盐水作为对照。造模后24小时对各组小鼠进行组织病理、肝功能、蛋白组学、透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)、蛋白表达等检测。结果:ACY-1215可显著抑制ALF小鼠肝组织肝细胞坏死。蛋白组学分析显示,ACY-1215可显著恢复ALF小鼠肝细胞线粒体呼吸电子传递链功能,TEM结果也显示,ACY-1215预处理可减轻ALF小鼠肝细胞线粒体结构的破坏。此外,ACY-1215还可减轻ALF小鼠的肝脏活性氧水平,降低ALF小鼠肝脏Bax蛋白表达水平,并升高Bcl-2蛋白表达的水平。结论:ACY-1215可通过抑制肝细胞坏死对ALF小鼠起到保护作用,这可能与其抑制线粒体介导的凋亡途径相关。第三部分:抑制组蛋白去乙酰化酶6的表达可通过调节线粒体介导的氧化应激及TLR4-MAPK/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症目的:内毒素在急性肝衰竭的进展中有着重要的作用,其主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可激活巨噬细胞,合成和释放多种炎性因子,既可加重炎性反应,又可造成肝细胞损伤。组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)在炎症性疾病的发生发展中起着重要作用,但其调控炎症反应的机制尚不十分清楚。因此,本研究应用HDAC6抑制剂ACY-1215及沉默HDAC6对LPS诱导激活的RAW264.7巨噬细胞进行干预,探讨抑制HDAC6的表达对LPS激活的巨噬细胞的炎症抑制作用及其机制。方法:选择不同浓度的ACY-1215(0.1,1,10,100μmol)处理RAW264.7细胞24小时,并用不同浓度的ACY-1215预处理2小时后,应用LPS(1μg/ml)刺激24小时,随后进行流式细胞术检测,选择细胞活性最高的药物浓度进行后续研究。将细胞分为对照组,LPS组及ACY-1215组。应用LPS刺激24小时后收集细胞及上清,分别检测细胞α-tubulin和组蛋白乙酰化水平、炎性因子表达、线粒体结构和功能、活性氧水平、Toll-样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)及其下游丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核转录因子-κB(nuclear transcription factorκB,NF-κB)信号通路的表达情况。随后,用慢病毒转染构建HDAC6沉默的小鼠RAW264.7巨噬细胞稳转染品系,并将RAW264.7细胞分为对照组(Normal组),对照+LPS组(N+LPS组)、空转组(Control组)、空转+LPS组(C+LPS组)、HDAC6沉默组(HDAC6组)及HDAC6沉默+LPS组(H+LPS组),用含有或不含有LPS(1μg/ml)的培养基处理24小时。随后收集细胞和上清,并检测炎性因子、氧化应激、TLR4及MAPK/NF-κB信号通路蛋白表达等指标。结果:ACY-1215及沉默HDAC6可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎性因子的释放。ACY-1215还可改善LPS诱导的线粒体结构和线粒体膜电位损伤,抑制HDAC6还可降低LPS诱导的细胞氧化应激水平。此外,抑制HDAC6还可调控LPS所致的TLR4及其下游MAPK/NF-κB信号通路的异常表达。结论:抑制HDAC6对LPS激活的RAW264.7细胞的炎症反应有保护作用,这可能与其调节线粒体介导的氧化应激及TLR4-MAPK/NF-κB信号通路有关。