目的自建检测杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR基因mRNA转录水平表达的实验方法,选择已接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的供患者,在移植当天和移植后不同随访时间点动态检测各种激活性KIR(aKIR)基因和抑制性KIR(iKIR)基因的mRNA转录水平的表达,并结合临床资料,探讨各种aKIR和iKIR基因mRNA转录水平的表达其对移植预后的影响。方法选择2011年8月至2019年5月行异基因造血干细胞移植的260例患者及其供者,其中252对供受者用于研究动态检测KIR基因mRNA转录水平表达,236例髓系/淋系恶性血液病患者用于研究各种KIR基因型及表达与移植预后的相关性,随访时间截止2019年8月31日。供受者采用PCR-SSO方法进行KIR基因分型及KIR/HLA受配体模式分析。收集外周单个核细胞,自行建立荧光定量PCR方法,动态检测移植前后不同时间点供受者aKIR(包括2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DS1基因),iKIR(包括2DL1、2DL2、3DL1基因)mRNA转录水平的表达。根据移植后发生Ⅱ-Ⅳ度急性GvHD和中重度慢性GvHD归为GvHD组;无GvHD表现或发生轻度GvHD(包括0-I度急性GvHD和/或轻度慢性GvHD)归为免疫耐受组;外周血或骨髓再次出现原始细胞(比例>5%)或髓外浸润归为复发组,收集临床资料并进行统计分析。结果1.临床特征分析在236例恶性血液病患者中诊断为髓系恶性肿瘤156例,淋系恶性肿瘤80例。移植方式中接受单倍体移植患者114例,HLA相合的无关或亲缘供者移植122例。女供男42例,女供女29例,男供女55例,男供男110例。供患ABO血型相合119例,ABO血型不合1 17例。选择非女供男移植是复发的保护因素(HR:0.3;95%CI,0.2-0.8,P=0.01),女供男相比其他性别组合发生cGvHD的风险显著增高(HR:3.4;95%CI,1.8-6.5,P<0.001),供患ABO血型相合是复发的保护因素(HR:0.5;95%CI,0.2-0.9,P=0.04),CMV 感染是 aGvHD 发生的危险因素(HR:2.5;95%CI,1.3-4.6,P=0.004),接受单倍体移植的患者aGvHD发生率(64/114,56.1%)高于接受HLA相合的无关或亲缘供体移植患者(63/122,51.6%),但差异无统计学差异。不同移植方式、疾病类型、供患性别构成、ABO血型相合度、是否CMV感染对于患者的OS和LFS未发现显著性影响。2.移植后KIR基因的mRNA转录水平表达的规律性(1)采用KIR基因分型方法证实移植后受者均转变成供者KIR基因型,并将移植前受者不携带但在移植后表达供者的KIR基因,即为供者特征性KIR。在供者特征性组和非特征性组,2DS1、2DS3、2DS4、3DS1的mRNA转录水平表达,均在移植后1M即达到并超过移植当天供者水平。2DS4、3DS1在3M表达水平达到最高,2DS3、2DS1分别在1M和2M表达水平最高,之后逐渐缓慢下降,且在移植后1年内最终维持在接近供者移植当天的水平,达到免疫稳态。两组间在同一时间点上的KIR转录水平均未见统计学差异。(2)移植后不同随访时间点KIR基因表达的规律性,表现为在iKIR中2DL1、2DL2、3DL1在移植后转录水平逐渐明显升高,3M达到最高值,尤其是3DL1、2DL1在2M、3M与移植当天供者表达水平相比均存在显著性差异(P<0.001)。在aKIR中2DS3和2DS5在1M,2DS1在2M,2DS2、2DS4、3DS1在3M,分别达到最高表达水平,其中2DS2、2DS3在2M表达高于供者有统计学差异(P<0.05)。无论是iKIR还是aKIR,mRNA转录水平在达到自身最高值后呈现均缓慢下降趋势,至移植后1年接近移植当天供者水平,达到稳定表达的状态。3.KIR基因型、KIR/HLA受配体模式对于HSCT后造血重建的影响(1)供者为KIR-Bx基因型,移植后2DL1、3DL1的mRNA转录水平表达在植入不良组与成功组相比均显著降低(P<0.05);供者为KIR-AA基因型,植入不良组在移植后2DL1、3DL1的mRNA转录水平较植入成功组降低,但差异不具有统计学意义。(2)患者HLA-Bw4/Bw4纯合的平均血小板植入时间为16.0天,Bw4/Bw6杂合的平均血小板植入时间为19.5天,Bw6/Bw6纯合平均血小板植入时间为20.3天,三组之间比较有统计学意义(P=0.02)。4.在GvHD组、免疫耐受组、复发组中,各种KIR基因mRNA转录水平表达的差异(1)供者为Bx或AA基因型,GvHD组2DS4、2DL1、3DL1的中位转录水平均低于免疫耐受组。供者为Bx基因型时,1～2M时2DS4的表达在两者之间有统计学差异(P<0.05);2DL1、3DL1的表达在两组之间没有统计学差异。(2)GvHD组供者为Bx基因型中2DL1/2DS1、2DL2/2DS2在各时间点中位转录水平的表达较免疫耐受组均同步降低,尤其是2DS1在2M的表达在两者间有显著性差异(P=0.04);3DL1/3DS1在GvHD组1～3M时呈现不同表达趋势,3DL1的中位转录水平表达低于免疫耐受组,3DS1的表达高于免疫耐受组,但3DL1/3DS1的表达在两组间差异均不具有统计学意义。复发组2DL1/2DS1、3DL1/3DS1在移植后的中位转录水平均较免疫耐受组升高,2DL1、2DS1、3DL1在复发组的表达均高于GvHD组,2M时2DS1在复发组和GvHD组的表达有显著性差异(P=0.03),其他KIR的表达在三组间不具有统计学差异。(3)移植后aKIR(包括2DS3、2DS4、2DS5)在GvHD组的中位转录水平相较于免疫耐受组同步降低,GvHD组患者在1M时的2DS4和2M时的2DS5表达均显著低于同期的免疫耐受组(P=0.04),而2DS3的移植后表达在两组间差异未见统计学意义。(4)供者为KIR-AA和KIR-Bx基因型时,患者的2年LFS为56.6%和71.0%,2年OS分别为60.5%和71.7%,两组KM生存分析无统计学差异(P=0.08,P=0.06)。3DS1在高表达组和低表达组2年OS分别为92.5%和38.6%,差异有统计学意义(P<0.001)。结论自建RT-PCR实验方法经性能评估后可用于检测各种aKIR和iKIR基因mRNA转录水平的表达。患者在HSCT后转变为供者KIR基因型,各种iKIR和aKIR的mRNA转录水平表达在1M,均达到并超过了移植当天供者水平,且aKIR相比于iKIR在移植后更早呈现高表达态势。动态检测各种aKIR和iKIR基因的mRNA转录水平,与免疫耐受组相比,在发生GvHD组为低表达,复发组为高表达。尤其是aKIR中2DS1、2DS4、3DS1基因mRNA转录水平从低到高及持续高表达的变化过程,对于预示HSCT后GVHD发生、复发、OS、LFS有较显著的临床参考价值。因此,本研究结果为临床动态监测GvHD、复发评估提供新的实验指标,并为研究不同aKIR和iKIR基因的表达对于移植预后的影响提供实验依据。