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目的:白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)是IL-12分子家族中的促炎细胞因子,在炎性和自身免疫性疾病中起到重要的病理作用。IL-23R(interleukin-23 receptor)是IL-23的特异受体,可特异性传导IL-23刺激所产生的信号,在固有免疫与适应性免疫之间起到重要的调节作用。草鱼是我国最重要的淡水养殖品种,但其易遭受细菌、病毒和寄生虫等病原的感染,引发炎症乃至死亡。本研究旨在克隆草鱼IL-23R基因,分析其基因结构,明确其在草鱼生理及病理条件下基因表达模式的变化,揭示该基因在草鱼肠道炎症进程中的表达特征及作用。方法:(1)运用RACE技术克隆草鱼IL-23R全长cDNA,基于表达载体pET-28a(+)和大肠杆菌原核表达系统表达重组IL-23R蛋白,利用重组蛋白带有6个组氨酸(6 × His)标签的特性,使用Ni-NTA螯合亲和层析法纯化变性后的目的蛋白,然后将其梯度透析复性,最终获得具有生物活性的重组草鱼IL-23R蛋白(rgcIL-23R)。(2)以割胶纯化的rgcIL-23R为免疫原,制备抗草鱼IL-23R多克隆抗体(rgcIL-23R pAb),用ELISA实验检测多抗效价,Western blot验证其特异性,并通过草鱼肾组织细胞(C tenopharyngodon idella kidney,CIK)的间接免疫荧光实验检测细胞内源性IL-23R蛋白的表达情况。(3)运用qPCR技术检测正常草鱼各组织的IL-23R转录水平以及采用腹腔注射和肛灌两种方式使草鱼感染嗜水气单胞菌24 h后各组织中IL-23R的相对表达量。(4)肛灌不同剂量rgcIL-23R活性蛋白后,观察草鱼肠炎的病理特征,用qPCR检测炎症发生过程中肠道组织的IL-23R、IL-23p19、IL-23p40a、IL-23p40b、IL-23p40c、IL-17A/F1、IL-17N、IL-1β等基因的相对表达水平。肛灌嗜水气单胞菌刺激草鱼发生肠道炎症,12 h后肛灌20 ng/尾的rgcIL-23R pAb,利用qPCR技术检测肠道组织中IL-23R及炎症通路相关基因在肠炎发病进程中的表达变化,并通过组织切片观察rgcIL-23R pAb对肠道组织病理变化的影响。(5)用rgcIL-23R活性蛋白刺激CIK细胞,利用qPCR技术检测细胞内IL-23R、IL-23p19、IL-23p40a、IL-23p40b、IL-23p40c、STAT3、RORα、RORγ、IL-17A/F1、IL-17N 及 IL-1β等基因的 mRNA 表达水平;用 rgcIL-23R pAb处理LPS刺激后的CIK细胞,qPCR检测细胞内IL-23R及炎症通路相关基因的表达水平。结果:(1)草鱼IL-23R cDNA全长3252 bp,ORF长2589 bp,CDS区编码862个氨基酸,预测其分子量为96.6 kDa,有2个Ⅲ型纤连蛋白结构域(FN3),1个跨膜结构域,胞外区有多个糖基化位点。系统进化树分析结果显示,鱼类的IL-23R区别于鸟类、爬行类和哺乳类成为单独一支,草鱼与鲫鱼、鲤鱼、金线鲃以及斑马鱼等鲤科鱼类亲缘关系最近。(2)以割胶纯化的rgcIL-23R为免疫原制备抗草鱼IL-23R多抗,ELISA结果显示该多抗的效价为1:40000;CIK细胞间接免疫荧光与Western blot分析结果显示,所制备的抗草鱼IL-23R多克隆抗体可特异性识别原核表达的以及天然状态下的IL-23R蛋白。(3)草鱼IL-23R基因表达于草鱼各种组织,在正常鱼体中的表达量从高到低排序依次为体肾、头肾、脾脏、尾鳍、胸腺、鳃、心脏、肝脏、脑、肌肉、肠道、血液、表皮等组织。鱼体经嗜水气单胞菌感染后,IL-23R在相关组织中的表达量发生了变化:腹腔注射病原菌24 h后,尾鳍、肠道中的IL-23R极显著上调,在体肾、脾脏、心脏也显著上调,但鳃中IL-23R显著下调;肛灌病原菌24 h后,IL-23R在肝脏、肠道、胸腺、尾鳍、头肾、鳃、血液、脑组织中都极显著上调,只在肌肉中显著下调。(4)肛灌不同剂量的rgcIL-23R活性蛋白后,草鱼肠道IL-23R转录水平显著上调,在刺激72 h时达到最高,且15 μg/尾剂量时表达量最高,且肠道和体表出现了明显的炎症。IL-23p19、IL-23p40a、IL-23p40b和IL-23p40c基因均在第1 d出现表达量的大幅上调,随后出现不同程度的下降;炎症通路相关基因IL-1 7A/F1、IL-1 7N、IL-1β与IL-23R基因的表达水平变化与之类似。以肛灌嗜水气单胞菌后12 h产生肠道炎症的草鱼为对象,再肛灌rgcIL-23R pAb,可降低IL-23R及炎症相关基因的转录水平,减轻肠道炎症。(5)CIK细胞可表达IL-23R。rgcIL-23R及rgcIL-23R pAb都可引起细胞IL-23R mRNA表达水平变化。调节IL-23R基因的表达,可使炎症通路相关基因的表达量发生改变。结论:我们克隆并鉴定了草鱼IL-23R。草鱼IL-23R重组活性蛋白可诱导草鱼发生肠道炎症,抗草鱼IL-23R多克隆抗体可减轻肠道炎症,调节炎症通路部分基因的表达。因此,IL-23R是重要的炎症因子,在草鱼肠炎发病进程中发挥关键作用。