论文部分内容阅读
镰刀菌酸（fusaric acid, FA）是由镰刀菌产生的一种非寄主选择性毒素，是镰刀菌致病的主要原因之一。程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。PCD现象在生物界中是普遍存在的，对植物而言，PCD不仅是植物体正常生长发育不可缺少的过程，而且是植物抵抗病原物侵染的重要机制之一。为研究FA能否诱导烟草悬浮细胞发生PCD，并进一步探索其分子机制，本试验以烟草悬浮细胞为材料，采用形态学、药理学、分子生物学和生物化学等方法，对FA诱导的烟草悬浮细胞死亡的形态变化、生化变化和信号途径等进行了观察和检测，所得结果如下：1.采用伊文思蓝染色法测定FA诱导的烟草悬浮细胞死亡率并在光学显微镜下观察细胞形态。结果显示：FA浓度增大，细胞死亡率升高，其中100μmol/L FA诱导24h的细胞死亡率约为48%；光学显微镜下观察到活细胞不被染色，而死细胞被染成蓝色并且细胞质收缩。2.采用DAPI（4’,6-Diamidino-2-phenylindole）染色法在荧光显微镜下观察细胞核形态。结果显示：正常细胞的细胞核呈规则的圆形，染色质分布均匀；而细胞经100μmol/L FA诱导24h后，细胞核拉伸变形，内有空洞，染色质分布不均匀。3.采用琼脂糖凝胶电泳分析法和原位末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling, TUNEL）检测DNA片段化。结果显示：正常细胞基因组DNA为一条完整的带，而100μmol/L FA诱导24h的细胞基因组DNA有小片段形成；正常细胞TUNEL阳性核比例不足1%，而100μmol/L FA诱导处理24h后约有31%的细胞呈现TUNEL阳性核，17%的细胞呈现坏死；当FA浓度增大至200μmol/L时，TUNEL阳性核比例降至23%，坏死细胞升至46%。4.采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察细胞超微结构的变化。结果显示：100μmol/L FA诱导处理12h后，细胞发生质壁分离；液泡数目增多；细胞核异染色质凝聚并边集化；内质网池变大，核糖体脱落；线粒体双层膜被破坏，内嵴部分溶解。5.采用分子生物学和生物化学等方法检测FA诱导的烟草悬浮细胞死亡过程中的各项变化。结果显示：100μmol/L FA诱导处理细胞后，胞外过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）迅速积累，30min后出现第一个峰值，2h后达到最大值；NADPH氧化酶抑制剂DPI能够抑制FA诱导的细胞死亡，其抑制率约为65%；胞内胞外一氧化氮（nitric oxide,NO）迸发，在一定范围内呈现浓度和时间依赖趋势；抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase, APX）和过氧化氢酶（catalase, CAT）活性均降低；丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量增加，膜脂过氧化作用增强；线粒体膜电位下降，ATP（adenosine triphosphate,ATP）含量降低，线粒体ATP合成酶特异性抑制剂寡霉素（Oligomycin）能够抑制FA诱导的细胞死亡，其抑制率为73.9%；类caspase-3蛋白酶活性被激活，12h时活性最高，约为对照的4.7倍。6.通过药理学方法检测NO在FA诱导的烟草悬浮细胞死亡过程中的作用。结果显示：NO合成酶抑制剂L-NMMA（NG-monomethyl-arginine monoacetate）和NO清除剂cPTIO（2-（4-Carboxyphenyl）-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide）能够抑制细胞死亡和类caspase-3蛋白酶的活性，且cPTIO的抑制作用大于L-NMMA；Caspase-3蛋白酶特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO（Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-aldehyde）预处理后也明显抑制了细胞死亡，其抑制率约为56%。7.通过RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）检测FA诱导的烟草防卫基因PAL和PCD相关基因Hsr203J的表达。结果显示，FA诱导了PAL和Hsr203J的表达，并且NO清除剂cPTIO和NO合成酶抑制剂L-NMMA能够抑制PAL和Hsr203J的表达。综合上述结果，得出以下结论：FA诱导的烟草悬浮细胞死亡具有PCD典型特征；APX和CAT活性下降，细胞抗氧化能力降低，导致H2O2积累，H2O2促进了膜脂过氧化的发生，导致细胞膜系统的破坏；线粒体的形态和功能变化（膜电位下降、ATP含量降低、膜脂过氧化和Oligomycin抑制试验）是导致FA诱导PCD的重要步骤；NO通过调控类caspase-3蛋白酶活性参与FA诱导的烟草悬浮细胞PCD过程；NO还可以影响烟草防卫基因和PCD相关基因的表达。