【摘 要】
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枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）是发酵工业的常见菌株,具有较强的水解淀粉和蛋白质的能力,与酱香风味的形成密切相关。目前,枯草芽孢杆菌产酱香的机制仍不清楚。实验室前期利用B.subtilis BJ3-2发酵大豆,在中低温（37℃）下主要产豉香,中高温（45℃）以上主要产酱香。本研究利用B.subtilis BJ3-2菌株既产酱香又产豉香的材料优势,通过对B.s
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枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）是发酵工业的常见菌株,具有较强的水解淀粉和蛋白质的能力,与酱香风味的形成密切相关。目前,枯草芽孢杆菌产酱香的机制仍不清楚。实验室前期利用B.subtilis BJ3-2发酵大豆,在中低温（37℃）下主要产豉香,中高温（45℃）以上主要产酱香。本研究利用B.subtilis BJ3-2菌株既产酱香又产豉香的材料优势,通过对B.subtilis BJ3-2在37℃和45℃培养菌体的转录组和代谢组进行关联分析,筛选得到24个差异基因,通过查阅文献及代谢通路分析选择了uxa C（半乳糖醛酸异构酶）、uxa B（塔格糖酮酸还原酶）作为风味候选基因,并进行荧光定量PCR验证,研究其对枯草芽孢杆菌产酱香的影响。主要研究结果如下:1.对B.subtilis BJ3-2（在37℃和45℃培养）进行转录组测序和代谢组检测;对转录组测序数据进行分析,根据P<0.05,在3646个基因中共筛选出371个差异基因,其中有255个上调和116个下调;对代谢组检测数据进行分析,根据P<0.05,VIP>1,再除去无效差异代谢物,获得25个上调代谢物,125个下调代谢物,KEGG分析找到所有差异代谢物参与的代谢通路共58条,综合分析筛选得到与差异代谢物相关性较高的关键代谢通路38条;2.根据差异倍数、表达量以及所富集的代谢途径,选择100个差异基因和95个差异代谢物进行转录组与代谢组的关联分析,得到25条转录组与代谢组共有的代谢途径,其中包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、柠檬酸循环、戊糖与葡萄糖醛酸的相互转化、丁酸代谢、脂肪酸代谢等代谢途径;再根据存在于差异基因与差异代谢物重合的途径里进行筛选,得到24个差异基因,其中8个上调,16个下调;3.通过查阅文献,并进一步根据基因的差异倍数、表达量以及所调控的代谢途径,最终选择uxa C（半乳糖醛酸异构酶）、uxa B（塔格糖酮酸还原酶）作为研究的候选基因;4.选用16S r RNA为内参基因,对uxa C和uxa B进行荧光定量PCR验证,结果显示:uxa C、uxa B在45℃时的表达量分别为在37℃时的2.65倍、2.82倍,与转录组测序结果趋势一致;5.构建uxa C、uxa B同源重组敲除载体,将敲除载体转化至B.subtilis BJ3-2中,并通过革兰氏染色、PCR验证和测序验证,最终获得BJ3-2Δuxa C和BJ3-2Δuxa B敲除菌株;6.利用BJ3-2Δuxa C和BJ3-2Δuxa B发酵大豆,感官评价及GC-MS结果显示:BJ3-2Δuxa C与BJ3-2Δuxa B发酵的大豆较BJ3-2而言,酱香味增强,粘丝增多,颜色变深,乙偶姻的含量分别降低了6.826%、6.222%,四甲基吡嗪的含量分别增加了4.211%、5.104%。研究通过成功敲除uxa C、uxa B,发现uxa C、uxa B在45℃时通过戊糖与葡萄糖醛酸的相互转化途径影响酱香风味的形成。结合基因组学、转录组学和代谢组学,从多个层面分析酱香的变化,揭示相对复杂的酱香风味形成机制,对酱香食品的风味控制和品质控制具有重要的理论价值和生产指导意义。
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