羧酸酯酶是一种广泛存在于动物,植物及细菌等生物的多功能酶系。根据序列相似性和底物特异性,羧酸酯酶可以分为8个亚家族:α-酯酶,β-酯酶,保幼激素酯酶,乙酰胆碱酯酶,神经趋化蛋白,神经连接蛋白,gliotactin和glutactin。羧酸酯酶家族的基因功能高度分化,部分具有水解活性的α-酯酶或β-酯酶基因在昆虫触角中表达,具有降解性信息素和其他外源气味分子的功能,是昆虫体内重要的气味降解酶。近年来,昆虫触角羧酸酯酶对信息素和植物挥发性气味物质的降解研究使我们对羧酸酯酶基因功能有了新的认识。由于其在嗅觉系统中表达,并具有气味降解活性,因此它们参与了昆虫的嗅觉反应,在维持嗅觉的正常生理功能方面具有至关重要的作用。但是已有的其他研究,仅关注的是昆虫成虫触角中的羧酸酯酶的气味降解功能,但是幼虫的嗅觉组织中是否也存在羧酸酯酶基因的表达,它们能否对外源气味物质进行降解?这一问题值得进一步的研究。家蚕是鳞翅目昆虫的重要模式生物之一,在遗传学研究上具有重要地位。与果蝇、按蚊幼虫不同,家蚕幼虫生活在开放的陆地环境中,是一种寡食性的昆虫,其寄主植物气味信号浓度较低且易受到有毒物质如杀虫剂的影响。研究家蚕COEs幼虫嗅觉组织中羧酸酯酶对挥发性的寄主植物气味物质和杀虫剂的降解作用,可为其他鳞翅目害虫的防治奠定基础。本研究室前期研究发现,家蚕幼虫触角和下颚中至少存在11个羧酸酯酶基因的表达,其中部分基因与已鉴定的鳞翅目昆虫气味降解酯酶和信息素降解酯酶为直系同源基因。本文选取了在家蚕幼虫嗅觉感器表达的Bmae32,Bmae33,Bmae35羧酸酯酶基因,参照ESTs拼接结果设计了特异性引物,从家蚕头组织中克隆这3个基因,并利用生物信息学方法对这些基因编码的蛋白质序列进行预测和分析;利用半定量RT-PCR技术对这3个基因的组织表达模式进行分析;构建Bmae32和Bmae35的原核表达载体,并对Bmae35进行了外源诱导表达,表达产物经镍亲和层析柱纯化,Western blotting鉴定。结果如下:1.经cDNA克隆,家蚕羧酸酯酶Bmae32、Bmae33和Bmae35基因的完整编码序列长度分别为1623 bp、1656 bp和1581 bp,这3个基因均由3个外显子与2个内含子组成,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。Bmae32基因共分别编码540个氨基酸,其分子量为61.7kD,等电点为8.72,含有1个潜在的N-糖基化位点,19个磷酸化位点;Bmae33基因共分别编码551个氨基酸,其蛋白质分子量为62.15kD,等电点为5.87,含有7个潜在的N-糖基化位点,27个磷酸化位点;Bmae35基因共分别编码526个氨基酸,蛋白质分子量为59.19 kDa,等电点为6.39,含有5个潜在的N-糖基化位点,18个磷酸化位点。2.经Signal IP 3.0在线预测发现Bmae32,Bmae33和Bmae35可能分别含有24、24和15个氨基酸的信号肽,因此这三个蛋白可能均为分泌蛋白。与其他昆虫触角酯酶的多序列比对分析发现Bmae32,Bmae33和Bmae35编码的蛋白具有酯酶活性必须的催化残基:Ser,Glu和His,也保持着α-酯酶家族特征基序Gly-x-Ser-x-Gly。进化分析和序列相似性显示:家蚕这三个羧酸酯酶基因都属于α-酯酶家族,其中Bmae32基因与甘蓝夜蛾触角酯酶基因Mbra-EST可能为直系同源基因,氨基酸一致性为58.8%;Bmae33基因与多音天蚕气味降解酶Apol-ODE和海灰翅夜蛾触角酯酶Slit-EST可能为直系同源基因,与Apol-ODE氨基酸一致性为73.1%,与Slit-EST氨基酸一致性为64.6%;Bmae35与蛀茎夜蛾触角酯酶Snon-EST可能为直系同源基因,氨基酸序列一致性为48.6 %。3.表达模式分析表明:Bmae32基因在家蚕5龄第3天头,血液和丝腺组织中有高表达。Bmae33基因在头,马氏管和体壁组织中有高表达,而在Bmae35在各组织中均有表达,其中在头,脂肪体,马氏管,体壁和丝腺的有高表达。并且Bmae35在雌蛾信息腺中表达,与性信息素合成呈正相关,暗示该基因在信息素合成中起重要作用。4.在去除信号肽和分析酶切位点后重新设计引物克隆,以pET28(a)为表达载体,构建Bmae32和Bmae35重组表达质粒,并测序验证。将测序正确的重组质粒Bmae35/pET28(a)转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测发现该基因以包涵体形式表达,并以镍亲合层析柱纯化,Western blotting鉴定证实Bmae35基因在大肠杆菌中正确表达并得以纯化。