研究背景与目的前列腺癌是男性常见的肿瘤之一,研究有效的治疗手段以及寻找新的治疗靶点是目前前列腺癌的研究热点,随着研究的日渐深入,人们意识到肿瘤微环境在前列腺癌发生发展中的作用越来越重要。肿瘤微环境(tumormicroenviroment,TME)是由肿瘤细胞、多种基质细胞、细胞因子等成分构成的一种复杂的微环境,其与肿瘤的发生、进展有密切的联系。其中肿瘤相关的巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)通常在肿瘤进展中起关键作用,其通过细胞直接接触或分泌细胞因子的方式参与肿瘤进展的调控。近年来的研究显示肿瘤微环境中巨噬细胞对凋亡的肿瘤细胞的清除,即胞葬作用(efferocytosis)通过调控巨噬细胞的极化,以及释放相关炎症因子,进而产生有利于肿瘤生长的肿瘤微环境和促进肿瘤细胞的免疫逃逸,从而加速肿瘤的进展。PKCζ是蛋白激酶C(PKC)家族的成员之一,属于非典型PKC,其参与并调控肿瘤组织中的多种信号通路。目前的研究表明PKCζ是前列腺癌的一种抑癌基因,然而其是否通过调控肿瘤微环境从而影响肿瘤的发生与进展尚不清楚。本研究主要探讨前列腺癌中PKCζ的表达是否可以通过影响肿瘤微环境中巨噬细胞的胞葬作用从而调控肿瘤的进展,旨在为肿瘤选择性靶向治疗提供手段;同时也为抵抗肿瘤进展,增强癌症治疗的疗效奠定坚实的理论基础。研究内容与方法1.前列腺癌细胞中PKCζ的表达对巨噬细胞胞葬作用的影响1.1前列腺癌细胞PKCζ过表达的稳定株的效果验证使用慢病毒Lv-GFP和慢病毒Lv-GFP-PKCζ分别感染DU145细胞作为对照组和实验组,用嘌呤霉素筛选获取稳定株。分别提取稳定株细胞的总蛋白和总RNA进行感染效果验证。1.2前列腺癌细胞中PKCζ过表达对凋亡诱导因子TRAIL诱导凋亡作用的影响使用联科凋亡检测试剂盒,按照试剂说明书设置阳性对照和阴性对照组,实验组包括前列腺癌PKCζ-OE和PKCζ-CTL的DU145细胞,分别加入TRAIL处理24h后,检测各组细胞的凋亡情况。1.3前列腺癌细胞中PKCζ过表达对巨噬细胞胞葬作用的影响按照上述凋亡诱导条件,诱导前列腺癌DU145细胞凋亡后,按照1:1比例与巨噬细胞共培养作为实验组,以未经凋亡诱导的DU145细胞与巨噬细胞共培养作为对照组,20-24h后检测胞葬效果。1.4前列腺癌细胞中PKCζ过表达对前列腺癌细胞增殖、迁移的影响通过细胞增殖实验、细胞迁移以及划痕实验验证PKCζ过表达后前列腺癌细胞的迁移以及增殖能力。2.前列腺癌PKCζ的表达抑制胞葬作用及机制初探2.1收集PKCζ过表达以及对照组的DU145细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-qPCR和Western Blotting分析筛选影响胞葬作用的关键分子。2.2利用中和抗体进行回复实验,进一步验证前列腺癌细胞中PKCζ过表达影响胞葬作用以及前列腺癌细胞迁移的机制。2.3利用TCGA数据库分析前列腺癌组织中PKCζ与胞葬作用关键分子CD47的表达相关性。研究结果1.前列腺癌细胞中PKCζ的表达抑制巨噬细胞的胞葬作用1.1 成功验证PKCζ在前列腺癌细胞中的过表达效果1.2 前列腺癌细胞中PKCζ过表达抑制凋亡诱导因子TRAIL的凋亡诱导作用1.3 前列腺癌细胞中PKCζ过表达抑制巨噬细胞的胞葬作用1.4 PKCζ过表达抑制前列腺癌细胞增殖及迁移能力2.前列腺癌PKCζ通过调控CD47的表达抑制巨噬细胞胞葬作用以及癌细胞迁移能力2.1 前列腺癌细胞中PKCζ调控胞葬作用相关分子的表达2.2 前列腺癌细胞中PKCζ通过调控CD47的表达抑制巨噬细胞的胞葬作用2.3 前列腺癌细胞中PKCζ通过调控CD47的表达抑制前列腺癌细胞的迁移能力2.4 前列腺癌组织中PKCζ与CD47的表达呈正相关的关系,且与肿瘤相关免疫细胞的浸润密切相关结论1.前列腺癌细胞中PKCζ的表达抑制巨噬细胞的胞葬作用2.前列腺癌中PKCζ通过调控CD47的表达抑制胞葬作用及前列腺癌细胞迁移