第一部分LncRNA NRON在小鼠和TOF胚胎心脏中的表达及细胞分布背景:既往研究表明,lncRNA NRON与心肌病、心力衰竭及肿瘤发生等相关,在细胞质中可以作为scaffold与其他蛋白质组成复合体参与蛋白质的失活、转运,或作为“sponge”隔离mi RNA,参与与调节蛋白质的功能。这些研究所关注都是的lncRNA NRON与发育完成后的心脏疾病的关系,到目前为止没有文献报道lncRNA NRON与发育中的心脏或先天性心脏病的关系。法洛四联症（TOF）是复杂先天性心脏病中表型最多且最常见的类型,可以作为和心脏发育相关的研究对象。目的:阐明lncRNA NRON与发育中的心脏及TOF的相关性,并明确其在心肌细胞中的分布。方法:（1）收集C57BL/6J小鼠胚胎期（E9.5,E10.5,E11.5,E13.5天,E14.5）,生后7天（P7）及成年（Adult）的心脏,提取RNA后RT-PCR扩增lncRNA NRON,进行DNA凝胶电泳,构建lncRNA NRON时间表达谱。（2）利用RT-qPCR技术检测lncRNA NRON在C57BL/6J小鼠不同时期的表达量差异,从而明确与小鼠心脏发育时间的关联性。（3）收集人类平均胎龄在20周的正常胚胎心脏和TOF胎儿心脏各8例,取右心室组织提取RNA后RT-qPCR检测lncRNA NRON的表达量,观察两组间是否存在差异以明确lncRNA NRON与TOF的相关性。（4）利用RNAFish及亚细胞分离技术对lncRNA NRON进行心肌细胞亚定位。结果:（1）lncRNA NRON在小鼠胚胎发育的E10.5天开始表达,此后的胚胎期至成年均稳定表达。（2）lncRNA NRON的表达量并不均一,从E10.5至P7,呈现上升趋势,此后至成年时又逐渐下降。（3）与对照组相比,TOF组胚胎心脏中lncRNA NRON呈现明显低表达,差别有统计学意义（P<0.0001）。（4）在hESCs诱导分化的心肌细胞（h ESC-CM,HCM）及AC16人心肌细胞中,80%的NRON定位在细胞核中。结论:（1）lncRNA NRON的表达时间与小鼠心脏发育关键时间窗具有部分重合性,可能参与小鼠心脏的发育。（2）lncRNA NRON低表达和TOF的发生具有相关性。（3）lncRNA NRON主要分布在心肌细胞胞核中,为研究其在胞核中的作用奠定基础。第二部分敲除LncRNA NRON抑制hESCs向正常心肌细胞分化背景:先天性心脏病的发生与心肌分化异常密不可分。既往研究表明,多个和心肌分化相关的核心转录因子（NKX2.5、TBX5、GATA4）及信号通路（Wnt信号通路、TGF-β信号通路）的异常均和TOF的发生相关,提示心肌分化异常在TOF的发生中可能占据主导地位,任何导致心肌分化异常的因素均可能成为TOF的发生原因之一。第一部分研究发现,lncRNA NRON同心脏发育及TOF发生具有相关性,但同心肌分化的关系尚未明确。目的:利用人胚胎干细胞（hESCs）可以向心肌分化的特性研究敲除lncRNA NRON对心肌分化的影响。方法:（1）利用epi CRISPR技术构建hESCs细胞lncRNA NRON敲除株（NRON-KO hESCs）及空载对照细胞株（empty-vector hESCs）,内部引物（238bp）及外部引物（292bp）PCR产物凝胶电泳挑选纯合敲除和杂合敲除株,外部引物PCR产物测序验证敲除成功。（2）对构建好的两组细胞株进行体外诱导分化,电子显微镜观察分化过程中形态差异,细胞免疫荧光观察心肌细胞标志物差异。（3）RT-qPCR检测不同分化时期标志基因的表达差异。结果:（1）从50个单克隆细胞群落中成功挑选出2个纯合敲除细胞株和45个杂合敲除细胞株,外部引物PCR产物测序结果与敲除后连接片段序列一致,证明敲除成功。（2）empty-vector hESCs组细胞在诱导分化第8天开始看到第一簇跳动的心肌细胞,到第12天几乎90%以上的细胞可以看到跳动。而NRON-KO hESCs组细胞在分化期间及结束后始终未发现可以搏动的心肌细胞。细胞免疫荧光证实仅有少数细胞可见c Tn T标记,且荧光量明显低于对照组。（3）RT-qPCR结果显示,早期中胚层标志基因T和MIXL1的表达显著受到抑制（P<0.001）;心脏发育核心转录因子基因NKX2.5、MEF2C和GATA4转录水平在第4天、第6天和第8天时均显著低于对照组（P<0.001）,由此产生的结果是诱导分化的细胞相关的心肌标志物（ANP,BNP,α-MHC,β-MHC,TNNT2及TNNT3）的表达几乎消失（P<0.0001）。结论:敲除lncRNA NRON可以阻碍hESCs向功能性心肌细胞分化,表明lncRNA NRON对hESCs向心肌细胞分化必不可少。第三部分LncRNA NRON促进shp2在细胞核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化背景:shp2蛋白在细胞核中可去磷酸化Parafibromin,促进其与β-catenin形成复合体,从而激活经典Wnt信号通路。我们采用的体外分化方案是通过使用小分子物质调控Wnt/β信号通路即可完成hESCs向心肌分化,且心肌细胞分化效率高达98%。前两部分研究结果提示,lncRNA NRON主要定位在心肌细胞胞核中,敲除lncRNA NRON后hESCs不能分化成功能性心肌细胞。根据分化方案推测敲除lncRNA NRON可能对Wnt/β-catenin信号通路产生了干扰而导致hESCs无法向心肌细胞分化。目的:验证lncRNA NRON对Wnt/β-catenin信号通路的调控及可能参与的蛋白质,进一步研究NRON参与心肌细胞发育调控及其潜在的机制。方法:（1）RT-qPCR检测诱导分化4天时敲除组与对照组中Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的转录水平,包括cyclin D1,Myc及Axin2。（2）构建NRON过表达质粒载体（pc DNA-NRON）,利用双荧光素酶报告基因检测lncRNA NRON对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。同时将构建好的NRON-KO hESCs和empty-vector hESCs细胞株分别提取RNA送测序。（3）提取AC16人心肌细胞胞核蛋白,利用RNA Pulldown及质谱分析技术（MS）寻找细胞核内与lncRNA NRON互作的蛋白质,Western blot（WB）验证结果。（4）WB检测对照组与敲除组中与NRON互作的蛋白质表达的差异。（5）利用双荧光素酶报告基因检测与NRON互作蛋白质的抑制剂对lncRNA NRON激活的Wnt/β-catenin信号通路的作用。（6）在AC16人心肌细胞中过表达lncRNA NRON,通过激光共聚焦观察对NRON互作蛋白细胞定位的影响。结果:（1）与empty-vector hESCs相比,Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因cyclin D1,Myc以及Axin2在NRON-KO hESCs组均表现为明显的下调,差别有统计学意义（P<0.001）,而β-catenin的表达未受影响（P>0.05）。（2）与仅转染β-catenin的细胞相比,同时转染pc DNA-NRON和β-catenin的HEK293T细胞的TOPflash活性提高了2倍,差别有统计学意义（P<0.01）。这一现象在仅转染pc DNA-NRON的细胞中也可以见到。（3）对敲除组和空载组细胞进行RNA-seq及KEEG富集分析,发现在NRON-KO hESCs细胞株中表达下调的基因在Wnt信号通路富集。（4）RNA Pulldown-MS发现shp2蛋白与NRON特异性结合,这一结果得到了WB的支持。（5）双荧光素酶报告实验显示由NRON过表达增加的TOPflash活性,在加入shp2的强效抑制剂TNO155后,TOPflash活性急剧下降了10倍以上,且差别有统计学意义（P<0.001）。（6）WB分析显示,shp2蛋白表达量在empty-vector h ESC组与NRON-KO h ESC组之间无差异,提示shp2可能不是NRON的靶基因（target gene）,而是一个伙伴基因（partner gene）。（7）激光共聚焦结果显示在同样密度的AC16心肌细胞中转染pc DNA-NRON,shp2主要聚集在细胞核内,而在转染空载的AC16细胞中,shp2主要聚集在细胞质内。结论:（1）lncRNA NRON可以激活经典的Wnt信号通路。（2）lncRNA NRON在细胞核内与shp2相互作用,通过促进shp2核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路参与调控心肌分化。