论文部分内容阅读
背景:川崎病(Kawasaki disease,KD)是一种全身性的自限性系统血管炎,年龄在3到5岁之间的儿童为主要好发人群,冠状动脉病变(Coronary artery lesions,CALs)是最突出的合发症,严重者可出现冠状动脉瘤、狭窄、血栓、心肌梗死等,现KD病因及发病机制尚不清楚。研究显示,炎症失控和免疫反应失衡在KD发病及冠状动脉损伤中起关键作用。维生素A(Vitamin A,VA)是人体内所必需的营养元素,在炎症、细胞凋亡和心血管疾病的发展进程中具有重要作用。但其与KD的关系尚未见报道。因此,本研究旨在探讨VA在KD患儿急性期的炎症及冠状动脉炎性反应过程中的作用及其机制。方法:(1)从KD急性期患儿(KD组)和健康对照组儿童(HC组)中抽取血清标本,将KD组分为KD无CALs组(KD-NCALs)和KD合并有CALs组(KD-CALs)。高效液相色谱仪(High performance liquid chromatography,HPLC)测定各组血清VA水平,血清TNFα、IL-6水平使用ELISA进行测定。(2)同时TNFα(50ng/ml)构建人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)炎性损伤模型,并与不同浓度视黄酸(Retinoic acid,RA)体外共培养,CCK8和流式细胞技术测定HUVECs的增殖和凋亡活性。PCR和Western-blot技术测定HUVECs的RARα、AKT、NF-κB与Caspase-3的基因及蛋白表达水平。RARα激动剂(Am580)、RARα抑制剂(Ro 41-5253)、AKT抑制剂(LY294002)及NF-κB抑制剂(SN50)体外处理HUVECs后加入TNFα联合RA共培养。HUVECs的凋亡情况通过流式细胞仪检测。RARα、AKT、NF-κB和Caspase-3的蛋白表达水平通过Western-blot检测。(3)通过干酪乳酸杆菌壁提取物腹腔单次注射实验小鼠构建冠状动脉炎动物模型,VA每日灌胃冠状动脉炎模型小鼠后,HPLC测定实验鼠血清VA水平,HE染色观察冠状动脉壁中的炎性浸润情况,RARα、AKT、NF-κB和Caspase-3的m RNA和蛋白表达水平通过PCR和Western-blot检测;采用VA每日灌胃与RARα激动剂(Am580)、RARα抑制剂(Ro 41-5253)、AKT抑制剂(LY294002)及NF-κB抑制剂(SN50)干预冠状动脉炎模型小鼠。HE及免疫组化染色观察冠状动脉炎性浸润情况。RARα、AKT、NF-κB和Caspase-3的基因和蛋白表达水平通过PCR和Western-blot检测。结果:(1)KD患儿在急性期的血清VA水平较健康儿童血清水平明显降低。KD组中VA血清水平与L%具有正相关联系,与WBC、N%、ESR、CRP、Pct具有负相关联系(P<0.05)。KD-CALs组血清VA水平与WBC、N%、ALT及IL-6具有负相关联系,与L%具有正相关联系(P<0.05)。(2)CCK8和流式细胞仪检测结果显示,RA(1-10μmol/L)干预HUVECs炎性损伤模型后增殖率明显升高,凋亡率明显降低(P<0.05);NF-κB的m RNA和NF-κB磷酸化蛋白水平明显降低(P<0.05);Cleaved-caspase-3蛋白水平明显降低(P<0.05);加入RARα激动剂和NF-κB抑制剂后HUVECs炎性损伤模型的凋亡率降低,加入RARα抑制剂和AKT抑制剂后HUVECs凋亡率增加;使用RARα抑制剂处理后,AKT的磷酸化蛋白表达水平明显降低(P<0.05);在RARα激动剂的作用下,NF-κB的磷酸化蛋白表达水平明显降低(P<0.05);同时,RARα抑制剂的作用下Cleaved-caspase-3的蛋白表达量明显增加(P<0.05)。(3)VA干预川崎病冠状动脉炎模型鼠后,血清VA浓度明显升高(P<0.05),冠状动脉炎性浸润得到改善。冠状动脉炎模型鼠在VA干预后心脏组织RARα蛋白水平、AKT的m RNA水平及磷酸化蛋白水平升高,NF-κB的m RNA和Cleaved-caspase-3蛋白水平表达降低(P<0.05);通过HE与免疫组化染色观察显示RARα抑制剂、AKT抑制剂作用下,冠状动脉炎性浸润明显增加,而在RARα激动剂、NF-κB抑制剂的作用下,冠状动脉炎性浸润明显降低。在使用RARα激动剂干预冠状动脉炎模型鼠后,AKT的基因及磷酸化蛋白表达量升高,而RARα抑制剂处理后,AKT的基因表达水平明显下降(P<0.05);同时,在AKT抑制剂的作用下,NF-κB、Caspase-3的基因表达水平明显升高(P<0.05),而在NF-κB抑制剂与RARα激动剂治疗后,Caspase-3的基因表达水平及Cleaved-caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:(1)VA参与了川崎病急性期的炎症反应过程,并可改善冠状动脉炎性浸润;(2)VA通过RA信号影响AKT/NF-κB的信号传导,从而调控凋亡蛋白Caspase-3表达,并参与KD及冠状动脉炎性反应的发展进程。