第一部分Rab5a是RSV在呼吸道上皮细胞复制所必需的宿主蛋白目的:呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是引起世界范围内婴幼儿急性下呼吸道感染最常见的病毒病原体之一,且目前尚无有效的疫苗预防特异性药物进行治疗。呼吸道上皮作为抵抗RSV感染的第一道防线,在抗病毒免疫中占有十分重要的作用,然而上皮中其宿主蛋白在抵抗病毒感染的作用尚不清楚。Rab家族蛋白作为囊泡运输的重要蛋白,在胞内及细胞间传递信号,参与免疫通路及炎症反应;此外,有文献报道称Rab蛋白作为重要的宿主蛋白参与病毒复制复合物的形成而影响病毒的复制,亦会影响病毒入胞后病毒生命周期的一系列过程。故此部分主要研究Rab蛋白在RSV感染呼吸道上皮细胞中的作用方法:用siRNA敲减Rab家族常见蛋白的表达（Rab1a、Rab2a、Rab4a、Rab5a、Rab6a、Rab7a、Rab8a、Rab9a、Rab11a）,再以RSV感染A549,检测合胞病变情况及检测RSV N基因拷贝数,筛选出与RSV复制密切相关的Rab蛋白。明确Rab5a是影响RSV感染的重要Rab蛋白后,收集RSV感染A549后1h、2h、6h及12h的细胞标本,WB及PCR分别检测Rab5a蛋白及基因表达水平;Rab5a siRNA预处理A549后构建RSV感染模型,在4℃环境完成病毒吸附实验,清洗未结合的病毒颗粒后在37℃环境下完成病毒入胞实验,通过免疫荧光及免疫共沉淀实验检测这两个过程中RSV的病毒颗粒数及RSV N蛋白的表达水平;空斑实验检测RSV感染后12h、24h、36h、48h的RSV病毒滴度。构建干预Rab5a活性部位的质粒,预处理A549细胞后予RSV感染,PCR检测RSV的N基因拷贝数。结果:1、RSV感染A549模型中,敲减Rab1a、Rab2a、Rab4a、Rab5a、Rab6a、Rab7a、Rab8a、Rab9a、Rab11a均会影响RSV的感染,影响合胞体的形成;2、Rab家族蛋白中Rab4a、Rab7a、Rab8a、Rab9a、Rab11a蛋白水平的降低,使RSV N基因拷贝数均明显降低（P<0.05）,但是合胞病变面积较对照组无明显差异;Rab5a的敲减不仅明显降低RSV N基因的拷贝数（P<0.001）,也明显减小RSV引起的合胞病变;3、RSV感染促进A549中Rab5a的基因及蛋白水平表达,均有统计学差异（P<0.05）,且呈时间依赖性;4、在RSV感染A549的模型中,RSV吸附及入胞的病毒颗粒数及RSV N蛋白的表达在siRab5a组与siCON组之间无统计学差异;5、RSV感染A549 12h、24h、36h、48h后,RSV的病毒载量随着感染时间的延长逐渐增多,在36h时间点达到峰值,48h水平仍处于高点,敲减Rab5a使RSV的病毒载量自12h后均显著低于未敲减组（P<0.001）;6、Rab5a活性位点活化后,RSV N基因拷贝数明显升高（P<0.01）,而使活性位点失活后,拷贝数明显降低（P<0.01）。结论:Rab5a影响RSV感染呼吸道上皮后的合胞体体积,在不影响病毒吸附和入胞的同时,促进RSV的复制,是RSV在呼吸道上皮细胞复制所必需的宿主蛋白。第二部分Rab5a介导RSV感染呼吸道上皮后的炎症反应目的:第一部分证实了Rab5a是RSV在呼吸道上皮细胞复制所必需的宿主蛋白,影响RSV的感染,但尚无研究指出Rab5a是否影响RSV引起的炎症反应,故此部分我们从体内模型及临床NPA标本中研究Rab5a在RSV引起的炎症反应中的作用。方法:RSV感染小鼠模型,收集感染后12h、24h、36h、48h、72h的肺组织标本,WB及PCR分别检测Rab5a蛋白及基因表达水平,免疫荧光检测Rab5a的表达水平及表达部位;Rab5a shRNA滴鼻敲减肺组织Rab5a蛋白水平后构建RSV感染模型,空斑实验检测RSV感染后1h、2h、6h、3d肺组织的病毒滴度,RSV感染5d后小鼠BALF计数炎性细胞总数及肺组织切片HE染色并进行炎症病理评分。收集了2016年10月至2017年3月因单纯RSV感染引起的急性下呼吸道感染在重庆医科大学附属儿童医院礼嘉呼吸科收治住院患儿的NPA标本,PCR检测NPA标本中RSV N基因拷贝数、Rab5a基因表达水平,ELISA检测NPA标本中IFN-λ蛋白水平,按王氏评分表对患儿病情严重度进行评分,将Rab5a表达水平与RSV N基因拷贝数、病情严重度评分、IFN-λ水平进行相关性分析。结果:1、RSV感染的小鼠模型中,Rab5a主要表达在肺组织的气道上皮细胞中,感染组较未感染组Rab5a基因及蛋白水平均明显升高,且在感染后36h达到峰值（P<0.01）;2、在RSV感染小鼠模型中,RSV感染1h、2h、6h的病毒滴度在shRab5a组及sh CON组之间无统计学差异,且在RSV感染6h的BALF及BALF肺组织中,shRab5a与sh CON组病毒滴度无统计学差异;3、敲减Rab5a降低了小鼠肺组织的病毒滴度及RSV N基因拷贝数（P<0.001）;4、敲减Rab5a明显减轻了小鼠BALF中的炎性细胞计数及肺组织炎症（P<0.01,P<0.001）;5、RSV感染引起ALRI患儿NPA标本的Rab5a基因表达水平表达升高（P<0.01）,且与RSV引起的病情严重程度呈显著正相关（P<0.01）;6、NPA标本中Rab5a表达水平与RSV N基因拷贝数呈显著正相关（P=0.01）;7、NPA标本中RSV感染组IFN-λ水平显著低于未感染组（P<0.001）,且随着住院时间的延长而逐渐降低;8、RSV感染引起ALRI住院患儿NPA中Rab5a水平与IFN-λ水平呈显著负相关（P<0.05）。结论:RSV促进呼吸道上皮细胞Rab5a的表达,且Rab5a促进RSV的复制,增强了RSV引起的肺部炎症反应。第三部分Rab5a通过抑制IRF1依赖的IFN-λ产生介导抗病毒免疫应答目的:Rab5a在病毒感染中占有重要作用,它不仅参与病毒的内吞及微泡形成,也与固有免疫应答密切相关,而干扰素是清除病毒的重要因子,包括Ⅰ型IFN及Ⅲ型IFN。文献报道Rab5a参与的早期内体,与IFITM家族的IFN诱导的膜蛋白密切相关,且早期内体与Ⅰ型干扰素受体相关,提示Rab5a与IFN存在密切关系。此外,研究指出IRF1作为呼吸道上皮细胞中对抗病毒感染的重要转录因子,是IFN表达中重要的调节因子,故此部分研究Rab5a是否通过影响IRF1从而调节IFN的表达水平介导抗病毒免疫应答。方法:用Rab5a敲减siRNA（siRab5a）及其对照（siCON）预处理A549细胞24h后,以MOI为1感染RSV后,收集细胞上清用ELISA检测IFN-α、IFN-β、IFN-λ水平,收集细胞PCR检测相应的基因水平;免疫荧光及WB检测A549细胞核内IRF1表达水平;构建IRF1敲减siRNA（si IRF1）预处理A549后,收集培养上清用ELISA检测IFN-λ水平。用特异性敲减Rab5a的慢病毒（shRab5a）及其对照（sh CON）滴鼻敲减小鼠肺组织Rab5a后,以1x10^7 PFU的RSV感染小鼠12及24小时后,收集小鼠肺组织,取肺匀浆上清ELISA法检测肺组织的干扰素水平。WB检测小鼠肺组织IRF-1蛋白水平,免疫荧光检测小鼠肺上皮IRF-1的入核表达水平。用特异性敲减Rab5a及IRF1的慢病毒（shRab5a）滴鼻敲减小鼠肺组织Rab5a及IRF1后,WB检测小鼠肺组织IRF1水平,ELISA检测小鼠肺匀浆上清IFN-λ水平。结果:1、RSV感染A549后,IFN-α、IFN-β及IFN-λ蛋白及基因水平均明显升高（P<0.001）;敲减Rab5a后,IFN-α及IFN-β蛋白水平、基因水平轻微升高,而IFN-λ蛋白及基因水平明显升高（P<0.01）;2、RSV感染小鼠12h、24h后,肺组织匀浆结果发现IFN-λ水平明显降低（P<0.001）,敲减Rab5a后,IFN-λ水平较sh CON组明显升高（P<0.001）;3、RSV感染A549模型中,IRF1入核表达量增多（P<0.001）,敲减Rab5a后进一步促进IRF1的入核;4、RSV感染A549模型中,IRF1敲减组IFN-λ水平较其对照组明显降低（P<0.01）,而同时敲减Rab5a及IRF1后的IFN-λ水平较单独IRF1敲减组升高且有统计学差异（P<0.01）;5、RSV感染后,小鼠肺组织IRF1表达增多,敲减Rab5a后IRF1水平明显升高（P<0.05）,且主要表达在肺组织上皮细胞中,入核表达量增多（P<0.01）,Rab5a敲减更能促进IRF1入核（P<0.01）;6、RSV感染模型中,小鼠肺匀浆中IFN-λ水平较未感染组明显下降;敲减Rab5a使IFN-λ水平明显升高（P<0.001）,在敲减Rab5a的同时敲减IRF1表达,IFN-λ水平较单纯Rab5a敲减组明显降低（P<0.01）。结论:RSV感染的呼吸道上皮细胞中,Rab5a表达增多,Rab5a通过调控IRF1下调IFN-λ水平抑制上皮细胞的抗病毒免疫应答。