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目的:建立一种简便、高效脐带间充质干细胞分离方法。方法:脐带组织剔除血管后,余下的组织用不同酶混合液消化,消化后的细胞悬液培养在含10ng/mlbFGF和10%FBS的DMEM/F12培养基中,粘附层细胞用胰酶消化传代培养。通过流式细胞术及免疫细胞化学方法检测细胞的免疫表型,在标准的成骨成脂诱导分化条件下检测细胞的分化潜能。结果:脐带组织应用中性蛋白酶、胶原酶Ⅰ和透明质酸酶混合液消化后,每5cm长度的脐带可分离1×10~6单个核细胞,培养10天后可得2.2×10~6细胞。传代培养后,细胞为均一的成纤维样长梭形。应用此种方法在分离难度、细胞得率等方面明显优于其它酶或酶混合液消化方法。分离培养后的细胞,倍增时间为(34±4)h,表达与骨髓间质细胞一致的表面标志(CD29、CD90、vimentin、SMA、desmin).不表达造血和内皮细胞标志(CD34、CD45、CD31、KDR),并表达多能干细胞标志(SSEA4、OCT-4),同时具有向成骨、成脂细胞分化的能力。结论:应用三种酶的混合液消化间质组织分离脐带间充质干细胞,操作简便,分离过程中,保持了细胞活力,细胞产量高,可以为临床应用提供大量高质量种子细胞。目的:探讨脐带间充质干细胞能否在体外向胰岛素分泌细胞分化。方法:用含β-巯基乙醇、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27及尼克酰胺的高糖DMEM培养基诱导脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化。相差显微镜下观察细胞形态变化;诱导阶段采用流式术检测PDX-1的表达;诱导后采用免疫化学染色检测胰岛素和C肽的表达;化学发光法测定低糖/高糖刺激下胰岛素的分泌情况;RT-PCR检测胰腺相关基因的表达,如Ngn3、insulin、glucagon和somatostatin的表达。结果:诱导后细胞形态由长梭形逐渐变圆而且聚集成团,诱导第二阶段表达PDX-1,诱导第三阶段后细胞免疫化学染色表达胰岛素和C肽,诱导组细胞经高糖刺激后释放胰岛素,RT-PCR可检测到insulin、Glucagon、Somatostatin、ngn3等胰岛相关基因。结论:人脐带间充质干细胞在特定的条件下可诱导分化为具有分泌胰岛素功能的胰岛样细胞。目的:观察hUCMSCs联合脐血干细胞在Ⅰ型糖尿病治疗中的作用。方法:连续小剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)给C57/BL6雄鼠,观察血糖浓度与糖耐量水平,建立Ⅰ型糖尿病小鼠模型。建模后,将hUCMSCs与脐血干细胞按不同比例,细胞总数量2×10~6细胞,通过尾静脉移植给受亚致死剂量(300cGy)照射后小鼠,观察血糖变化。移植后28天,胰腺组织切片行人源胰岛素免疫化学染色检测植入细胞是否分化为胰岛素分泌细胞,HE染色和小鼠胰岛素免疫化学染色检测受损的胰岛是否得到修复。为了解植入细胞在组织中的定位,免疫化学染色法检测肾脏及胰腺组织切片中的人核抗原,抽提肾脏及胰腺DNA经PCR方法检测人特异性Alu基因。结果:注射STZ后7天,两次随机血糖大于16mmol/L的小鼠为Ⅰ型糖尿病小鼠。将hUCMSCs与脐血干细胞按1:4比例移植入糖尿病小鼠体内,能明显地改善胰岛的结构和功能,小鼠血糖水平明显降低,胰岛素分泌细胞的数量增加。然而在移植小鼠的胰腺没有检测到人胰岛素分泌细胞和人核抗原。进一步,通过检测人特异性Alu基因,分析了移植小鼠胰腺和肾脏组织中是否存在移植细胞。结果显示,在部分移植小鼠体内存在人特异性Alu基因DNA,提示移植细胞在糖尿病小鼠胰腺和肾脏组织中存在。结论:hUCMSCs联合脐血干细胞移植后可定位于Ⅰ型糖尿病惺蟮囊认偌吧鲈?修复受损的胰腺组织,具有降血糖作用。