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结肠癌是最常见的消化道肿瘤之一,世界范围内每年新增结肠癌患者102万,并有约53万人死于结肠癌。其发病率在我国恶性肿瘤发病率中位列第5,并且以4.2%的增速持续增长,远远高于2%的国际水平。目前,结肠癌治疗首选是手术治疗,通过外科手术将肿瘤组织切除,但由于可能存在微转移灶,肿瘤组织切除后仍有很高的复发和转移几率,所以大多数结肠癌患者还需要进行化疗和放疗,以减少复发。分子靶向药物的发明为结肠癌治疗提供了新的途径。分子靶向治疗是以肿瘤细胞上较普通细胞显著高表达的蛋白为基础,合成针对该蛋白的阻断药物,从而选择性的杀死肿瘤细胞。研究发现,胆囊收缩素2型受体(即CCK2R)在诸多肿瘤细胞尤其是结肠癌细胞上过表达,因此可以作为鉴别肿瘤的分子标记物。由于CCK2R与胆囊收缩素(CCK)高度亲和,因此,本研究创新性的将CCK与绿脓杆菌外毒素(PE)通过基因工程技术,融合成为新型重组毒素,可以特异性的结合并杀死CCK2R高表达的结肠癌细胞,为结肠癌的非手术治疗方案提供了指导。研究发现,胆囊收缩素CCK在肿瘤细胞的浸润和转移过程中发挥重要作用,这种作用主要是通过与CCK2R的高度亲和性实现的。因此在本研究中,使用基因工程技术将CCK上具有靶向CCK2R功能的第96至104号氨基酸Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly反向编译为Gly-Phe-Asp-Met-Trp-Gly-Met-Tyr-Asp的重组型r CCK96-104,并利用柔性linker HMAEE连接在PE38毒素N端,组合成为新型重组毒素r CCK96-104PE38基因。主要优点是将CCK的活性中心暴露出来,以利于重组毒素与细胞上CCK受体特异结合。将该重组毒素DNA片段与p ET28a质粒重组连接,并转化到大肠杆菌BL21,构建了重组毒素的原核表达载体BL21(DE3)(p ET28a-r CCK96-104PE38),通过0.1 m M的IPTG诱导,16℃连续摇培18 h后,成功表达出可溶性的重组毒素r CCK96-104PE38。设计的重组毒素蛋白含有6聚组氨酸标签,可通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,为进一步减小重组毒素的免疫原性,使用r TEV蛋白酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶)将组氨酸标签切除。为了尽可能保持重组毒素活性,使用冻干方式保存蛋白,5%麦芽糖作为冻干保护剂。经间接免疫荧光、流式细胞术等实验验证了重组毒素r CCK96-104PE38能够特异性吸附高表达CCK2R的结肠癌细胞,并在内化后引起细胞凋亡,而对低表达或不表达CCK2R的细胞没有显著影响。使用CCK-8法测定了r CCK96-104PE38对多种细胞的半抑制率浓度(IC50),初步确定了r CCK96-104PE38的结肠癌靶向。建立了HCT116结肠癌裸鼠肿瘤模型,通过尾静脉连续给药的方式,结果证明r CCK96-104PE38蛋白能够有效抑制肿瘤组织生长和扩散,且毒副作用弱(本实验没有发现可见副作用),适合长期给药治疗。以上结果说明重组毒素r CCK96-104PE38是一种很有潜力的结肠癌靶向药物,有望为结肠癌的非手术治疗提供新的途径。