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目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌的其中一种类型,是目前较为常见的恶性肿瘤之一[1],感染HBV能引起急性、慢性肝炎,同时也是引发肝细胞癌的一个重要危险要素[2,3]。HBV是一种环状部分闭合的双链DNA病毒,编码四种主要的病毒蛋白:HBV多聚合酶、HBV包膜蛋白、HBV核心蛋白和HBx蛋白。大量研究表明:HBx在病毒感染和肝癌的产生中扮演着重要的作用[4,5],但目前HBx诱导HCC发生发展的具体机制尚不明确。一型不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白（SAMHD1）是细胞内一种d NTP三磷酸水解酶,能够调控胞内dNTP的代谢水平[6]。如今报道SAMHD1能抑制HIV和HBV病毒DNA的复制[7,8]。同时,SAMHD1在肺癌中表达下调[9],在急性髓细胞白血病中能抑制细胞增殖[10,11],提示着其是一种潜在的抗癌因子。但目前SAMHD1在HCC的功能尚不清楚,同时HBV是否能调控SAMHD1及具体的机制尚不清楚,因此本课题探索了HBx调控SAMHD1泛素化降解,促进HBV诱导的HCC的潜在作用及机制。方法:第一部分:SAMHD1对HBV感染的肝癌细胞影响及机制研究。1.首先通过Western blot测定了15对乙肝病毒感染的肝癌样本以及相应癌旁组织中SAMHD1蛋白的表达情况,利用CRISPR-Cas9技术,设计特异性的gRNA在HBV整合的肝癌细胞HepGAD38上构建稳定敲除SAMHD1（KO-SAMHD1）的细胞系。3.经由MTT细胞增殖、克隆形成试验研究敲除SAMHD1在HepAD38细胞上对增殖的影响。4.在KO-SAMHD1的HepAD38细胞中检测分别采用RT-qPCR和Western blot检测细胞周期蛋白（cyclin A、cyclin B、cyclin D和cyclin E）、周期蛋白依赖性激酶（CDK1、CDK2、CDK4和CDK6）、细胞周期蛋白抑制剂/激酶抑制剂（p21和p27）转录和蛋白程度的表达情况。5.在KO-SAMHD1的HepAD38细胞中分离细胞浆与细胞核蛋白,Western blot检测p27在胞浆胞核中定位模式的改变。6.Western blot分析KO-SAMHD1后Akt以及活化形式p-Akt的蛋白表达水平变化。第二部分:HBx调控SAMHD1降解的机制研究。1.在肝癌细胞Huh7.0上分别过表达HBV编码的三种病毒蛋白:HBs,HBc和HBx;Western blot检测过表达上述三种病毒蛋白下SAMHD1表达情况的转变。2.在Huh7.0和HepG2细胞上梯度过表达HBx,分别在mRNA和蛋白水平上检测SAMHD1表达的转变。3.使用放线菌酮或MG132处理后,检测HBx对SAMHD1蛋白半衰期和泛素-蛋白酶体的影响。4.Co-IP实验检测HBx与SAMHD1的结合情况,泛素化IP检测HBx是否影响SAMHD1泛素化程度。5.构建HBx片段缺失突变体,通过IP实验检测HBx结合SAMHD1的区段。结果:第一部分:SAMHD1对HBV感染的肝癌细胞影响及机制研究。1.SAMHD1在HBV感染的肝癌组织中表达量较相对应的癌旁组织明显下调。2.KO-SAMHD1基因后,HepAD38的细胞增殖能力明显增强,细胞周期G2/M所占比例增加,G2/G0期占比减少,然而细胞中各个阶段的凋亡未检出明显的差异。3.qPCR同Western blot结果显示KO-SAMHD1后p27在mRNA和蛋白水平的表达减弱,p-CDK2和p-Rb表达水平增加。4.敲除SAMHD1后,未在HepAD38中检出Akt蛋白表达程度的显著差异,但其活性状态的磷酸化形式p-Akt蛋白水平增加。4.经由胞浆胞核蛋白抽提处理后,Western blot结果表明p27的核定位出现重新分布,部分由胞核转移至胞浆。第二部分:HBx调控SAMHD1的分子机制研究。1.在肝癌细胞Huh7.0中过表达HBx后SAMHD1蛋白水平明显下调,而过表达HBc或HBs并未出现相应的表型。2.在Huh7.0或HepG2细胞上梯度过表达HBx,结果表明SAMHD1在蛋白水平,而非RNA水平上表达下调。3.使用放线菌酮处理后,过表达HBx组的SAMHD1蛋白的半衰期时间显著缩短;MG132处理后HBx对SAMHD1蛋白的下调作用消失。4.Co-IP实验证实HBx与SAMHD1存在相互结合作用,泛素化IP表明HBx过表达后引起SAMHD1泛素化水平提升。筛选HBx和SAMHD1的IP实验表明HBx蛋白的C段（AA130-154）是与SAMHD1蛋白结合的关键区域。结论:SAMHD1蛋白在HBV感染的肝癌组织中低表达;SAMHD1通过Akt/p27信号通路,影响p27的核定位和转录水平的表达,从而抑制肝癌细胞（HepAD38）的增殖和细胞周期停滞。HBV编码的病毒蛋白HBx通过C端（AA130-154）与SAMHD1相互结合,并通过泛素-蛋白酶体途径影响SAMHD1的泛素化程度降解SAMHD1,从而影响SAMHD1在肝癌发生发展的作用。