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目的:肝细胞癌（HCC）以恶性度高及预后差为特点,对于晚期肝细胞癌患者全身化疗是延长生存期的最常用治疗策略。对肝细胞癌的分子生物学研究能够发掘早期诊断的标志物,并用来评价预后,作为治疗的靶点,并能使化疗增敏,减少化疗药的应用剂量。阿霉素（ADM）是晚期肝癌治疗中最主要的化疗药物,但阿霉素耐药是影响化疗效果的主要因素。miRNA参与大部分肿瘤的增殖、凋亡及侵袭等恶性行为,并对肿瘤化疗耐药具有调控作用。在HCC患者的血清中,miR-505表达改变,而高迁移族蛋白1（HMGB1）对肝癌的化疗具有致耐药作用,经过生物信息学预测,二者具有靶向调节关系。目前还没有miR-505在肝癌细胞中的作用及机制研究。本研究对miR-505与HMGB1在肝癌细胞增殖、侵袭、EMT及凋亡等恶性行为进行了检测,并观察了miR-505对阿霉素诱导肝癌细胞毒性的作用及机制,目的在于观察miR-505在肝癌组织及细胞中的表达水平及功能的调控,探讨miR-505对HMGB1的调控作用及对ADM诱导的肝细胞癌毒性的作用及机制,为肝癌的早期诊断、预后评价、治疗靶点及化疗耐药的调控提供新的靶基因。研究方法:1.观察肝细胞癌组织及细胞中miR-505及HMGB1表达水平差异,应用qRT-PCR检测miR-505及HMGB1mRNA在人肝癌组织、配对人正常肝脏组织、四种人肝癌细胞株（QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97、HepG2）及人正常肝细胞株（LO2）中的表达。应用Western blot检测HMGB1在以上标本中蛋白水平表达。2.为了证明miR-505及HMGB1是否参与MHCC97的增殖、凋亡及侵袭行为,以miR-505 mimics或pcDNA3.1-HMGB1上调miR-505或HMGB1表达,以anti-miR-505或HMGB1-siR下调miR-505或HMGB1表达,分别转染到MHCC97中。在转染后以qRT-PCR进行mRNA水平转染效率验证,以Western blot验证HMGB1蛋白转染效率。以MTT法检测不同转染条件下MHCC97细胞增殖,Western blot法检测不同转染条件下MHCC97细胞Ki67蛋白表达,以流式细胞术进行细胞凋亡检测、以Transwell法检测细胞侵袭能力。3.观察不同的人肝癌细胞（QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97、HepG2）对ADM敏感性及miR-505、HMGB1对ADM诱导的肝癌细胞毒性影响,采用MTT法对ADM干预下四种不同肝癌细胞表现的毒性作用进行了检测。选择对ADM敏感的MHCC97细胞及HepG2细胞,给予上调或下调miR-505及HMGB1表达,MTT法观察不同浓度梯度ADM诱导的肝癌细胞毒性变化。4.为了观察miR-505对MHCC97细胞中TGF-β诱导的EMT是否具有调控作用,以miR-505 mimics和anti-miR-505转染MHCC97细胞,qRT-PCR和Western blot观察EMT相关基因（N-cadherin、fibronectin、vimentin、E-cadherin）在mRNA和蛋白水平变化。5.采用荧光素酶报告进行确定HMGB1是否作为miR-505直接靶标。6.为了观察miR-505调控HMGB1下调对MHCC97细胞的增殖及侵袭是否具有抑制作用,对ADM诱导的肝癌细胞凋亡是否具有促进作用,我们通过siRNA转染MHCC97细胞,下调HMGB1的表达以模拟miR-505过表达对MHCC97细胞增殖及侵袭的作用,MTT法检测细胞增殖,Transwell法检测侵袭,流式细胞术检测凋亡。7.验证miR-505过表达通过下调HMGB1对ADM处理的肝癌细胞caspase-3活性的影响,采用Caspase-3活性检测转染HMGB1-siR、Con-siR,或分别联合0.5μM或0.75μM浓度ADM处理的MHCC97细胞及HepG2细胞中Caspase-3活性。8.以Western blot法检测MHCC97细胞及HepG2细胞在不同干预条件下γH2AX蛋白表达,观察下调HMGB1表达对ADM诱导的肝癌细胞DNA损伤作用。9.以Western blot检测转染Con-miR、miR-505、miR-505+Vector、miR-505+HMGB1及分别联合给予0.5μM或0.75μM ADM处理48h后的MHCC97和HepG2细胞中γH2AX表达,观察miR-505过表达是否通过下调HMGB1促进ADM诱导的肝癌细胞DNA损伤。10.采用Western blot法检测Akt信号通路蛋白p-Akt、Akt、p-GSK-3β和GSK-3β相对表达,进一步观察miR-505/HMGB1轴是否通过Akt信号通路调控ADM诱导的肝癌细胞毒性。结果:1.miR-505在人肝细胞癌组织及细胞（QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97、HepG2）中表达低于正常肝组织及正常肝细胞（LO2）,HMGB1蛋白及mRNA在人肝细胞癌组织及肝癌细胞中表达高于正常肝组织及正常肝细胞。2.miR-505对MHCC97细胞增殖、侵袭及ki67蛋白表达具有抑制作用,对凋亡具有促进作用,而HMGB1对MHCC97细胞增殖、侵袭及ki67蛋白表达具有促进作用,对凋亡具有抑制作用。3.给予不同浓度梯度ADM处理肝癌细胞,MHCC97对ADM最为敏感,其次为HepG2,miR-505能够增强ADM诱导的肝癌细胞毒性,而HMGB1减弱ADM诱导的肝癌细胞毒性。4.miR-505参与调控MHCC97细胞TGF-β诱导的EMT。5.miR-505以转录后方式直接抑制HMGB1的表达。6.miR-505通过抑制HMGB1表达抑制MHCC97的增殖及侵袭,促进ADM诱导的肝癌细胞凋亡。过表达HMGB1部分逆转了miR-505对MHCC97增殖和侵袭的抑制作用,也逆转了对凋亡的促进作用。下调HMGB1表达增强ADM诱导的肝癌细胞凋亡率。上调miR-505通过下调HMGB1表达增强ADM对肝癌细胞的杀伤作用。miR-505过表达增强ADM诱导的肝癌细胞凋亡是通过下调HMGB1表达实现的。7.miR-505通过下调HMGB1表达增强了ADM诱导的肝癌细胞中Caspase-3活性。8.下调HMGB1表达促进ADM诱导的肝癌细胞DNA损伤。9.miR-505过表达通过下调HMGB1促进ADM诱导的肝癌细胞DNA损伤。10.下调HMGB1表达减少了p-Akt及p-GSK-3β的表达,抑制了ADM诱导的肝癌细胞中Akt通路的活性,上调miR-505表达通过靶向下调HMGB1抑制ADM诱导的肝癌细胞Akt及GSK-3β磷酸化。结论:1.miR-505在肝细胞癌组织及细胞中表达下调,对肝癌细胞增殖、侵袭及EMT行为具有抑制作用,促进凋亡,对ADM诱导的肝癌细胞毒性具有增敏作用。HMGB1在肝细胞癌组织及细胞中表达上调,对肝癌细胞增殖、侵袭行为具有促进作用,抑制凋亡,对ADM诱导的肝癌细胞毒性具有增加抗药性作用。2.miR-505直接靶向作用于HMGB1的3’-UTR端介导肝癌细胞增殖、凋亡及侵袭行为,并通过下调HMGB1来增强ADM诱导的HCC细胞毒性。3.miR-505靶向下调HMGB1抑制Akt通路从而增强ADM诱导的肝癌细胞毒性、促进凋亡、增强caspase-3活性。