【摘 要】
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目的:支气管哮喘（简称哮喘）的发病机制中气道慢性炎症扮演着重要作用,其发病机制未完全明确,气道平滑肌细胞（Airway smooth muscle cells,ASMC）在各种因素刺激下分泌的炎症因子可能参与这一发病过程。近年来发现,氨茶碱除了具有经典的支气管扩张作用外,还具有抗炎作用。但是氨茶碱对气道平滑肌细胞表达和分泌炎症介质的影响尚不明确。本文采用人气道平滑肌细胞（Human airway
【基金项目】
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项目名称:HMGB1/miR-19a在气道平滑肌（ASM）表型转换中作用及机制的研究,项目合同编号:81600020,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2017年01月-2019年12月
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目的:支气管哮喘（简称哮喘）的发病机制中气道慢性炎症扮演着重要作用,其发病机制未完全明确,气道平滑肌细胞（Airway smooth muscle cells,ASMC）在各种因素刺激下分泌的炎症因子可能参与这一发病过程。近年来发现,氨茶碱除了具有经典的支气管扩张作用外,还具有抗炎作用。但是氨茶碱对气道平滑肌细胞表达和分泌炎症介质的影响尚不明确。本文采用人气道平滑肌细胞（Human airway smooth muscle cells,HASMC）,探讨肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（Interleukin-1beta,IL-1β）和干扰素-γ（interferon gamma,IFN-γ）混合促炎因子干预HASMC后其表达及分泌炎症介质的影响;观察氨茶碱对人气道平滑肌细胞炎症介质表达和分泌的影响,探讨氨茶碱防治哮喘的抗炎机制。方法:以人气道平滑肌细胞为研究对象。（1）原代HASMC培养及鉴定:取胸外科肺癌做肺叶切除术患者的支气管标本,采用组织块贴壁法培养原代HASMC,细胞鉴定采用免疫荧光检测所培养细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-actin）表达。取3到6代细胞用于后续实验。（2）人气道平滑肌细胞经饥饿处理12h后,HASMC完全随机分配为6组:空白组、10μM氨茶碱组、TNF-α+IL-1β+IFN-γ组、10μM氨茶碱+TNF-α+IL-1β+IFN-γ组、100μM氨茶碱组、100μM氨茶碱+TNF-α+IL-1β+IFN-γ组,在细胞培养瓶中加入含1%胎牛血清DMEM培养基进行培养,24h后提取各组细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR检测白介素（IL）-6、白介素（IL）-8、CXC趋化因子配体10（CXCL10）、调节T细胞正常表达和分泌的细胞因子（RANTES）、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、血管内皮生长因子（VEGF）、趋化因子受体3（CXCR3）mRNA表达水平。（3）根据PCR的结果,取氨茶碱浓度为100μM用于以下实验。细胞饥饿处理12h后,HASMC完全随机分配为4组:A组（空白组）、B组（100μM氨茶碱组）、C组（TNF-α+IL-1β+IFN-γ组）、D组（100μM氨茶碱+TNF-α+IL-1β+IFN-γ组）,在六孔板中加入含1%胎牛血清DMEM培养液进行培养,24h后收集各组细胞上清,利用蛋白芯片技术检测各组炎症介质的分泌。结果:（1）组织块法培养原代细胞后,细胞呈梭形、纺锤形,细胞融合后呈典型的“峰-谷”型生长特征,细胞免疫荧光显示细胞内α-actin表达阳性率>95%以上。（2）荧光定量PCR结果显示:与空白组比较,TNF-α+IL-1β+IFN-γ组HASMC表达IL6、IL8、CXCL10、RANTES、Eotaxin、MCP-1、VEGF mRNA明显升高（P0.05）。结论:氨茶碱可以下调TNF-α、IL-1β及IFN-γ混合促炎因子诱导HASMC MCP-1及CXCL10 mRNA的表达,但不能抑制HASMC炎症介质的分泌,对HASMC可能无直接抗炎作用。
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