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体外合成生物体系组合不同来源的酶/酶复合物、辅助因子等,构建化学品的天然或非天然合成途径,通过多酶偶联催化实现目标化学品的生产。体外合成生物体系具有设计灵活、反应条件温和、目标产物得率高等优势,但也存在催化剂制备成本高、需添加昂贵的辅因子（如ATP、NADH等）等问题,其推广应用仍面临诸多的挑战。葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖,其生产技术成熟,价格相对低廉,是生物法生产化学品的理想原料。甘油是生物燃料生产过程中不可避免的副产物,存在严重的产能过剩问题,利用甘油为底物生产多种化学品,可提高生物燃料产业的经济可行性。丙酮酸是一种在食品、医药、化工和农用化学品等领域有着广泛用途的化学品,可转化为乙偶姻、乙醛、乳酸、L-酪氨酸等高附加值产品,其中乙偶姻是美国能源部列出的30种需优先开发利用的平台化合物之一。本论文旨在通过构建体外合成生物体系,以甘油和葡萄糖为底物生产丙酮酸,并进一步将丙酮酸转化为乙偶姻。课题组前期设计了一条以甘油为底物生产丙酮酸的非天然途径,该途径中关键酶来源于硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）的二羟基羧酸脱水酶DHAD催化活性较低,限制了体外合成丙酮酸的效率。论文第二章在前期研究的基础上对该非天然途径进行优化,通过酶活测定筛选到来源于Paralcaligenes ureilyticus的二羟基羧酸脱水酶PuDHT替代DHAD,偶联来源于天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）的醛醇氧化酶ALDO、PuDHT、来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的过氧化氢酶CAT,经反应条件优化,以甘油为底物生产丙酮酸的产物得率达到理论值的92.68%,生产效率达到4.75 mM h-1。进一步偶联来源于运动发酵单胞菌（Zymomonas mobile）的丙酮酸脱羧酶PDC,将丙酮酸转化为乙偶姻,产物得率达到理论值的78.70%,生产效率达到1.42mM h-1。另外,本章设计了一条以甘油为底物,通过偶联ALDO、CAT、来源于大肠杆菌（Escherichia acoli）的3-羟基羧酸脱氢酶GlxR和3-羟基丙酮酸异构酶Hyi、来源于Archaeoglobus fulgidus的L-丙氨酸脱氢酶AfALADH生产L-丝氨酸的非天然途径,利用体外催化实验验证了基于该途径生产L-丝氨酸的理论可行性。论文第三章设计了一条以葡萄糖为底物生产丙酮酸的非天然途径,通过偶联来源于黑曲霉（A.niger）的葡萄糖氧化酶GOX、PuDHT、ALDO、来源于嗜酸嗜热硫化叶菌（S.acidocaldarius）的2-酮基-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶KDGA、CAT,实现了基于葡萄糖的丙酮酸体外高效生产。该体外合成体系仅需5个酶即可以实现生物体内经糖酵解途径10个酶参与的代谢过程,且无需添加ATP、NADH等昂贵辅因子。通过对该体外合成体系的系统优化,经8 h催化可将20.75 mM葡萄糖转化为30.82 mM丙酮酸,产物得率达到理论值的74.27%,生产效率达到3.85 mM h-1。进一步偶联PDC,实现了基于葡萄糖的乙偶姻高效生产,经10 h催化可将21 mM葡萄糖转化为17.79 mM乙偶姻,产物得率达到理论值的84.71%,生产效率达到1.78 mM h-1。另外,本章设计了一条2,4-二羟基丁酸的非天然合成途径,尝试利用来源于E.coli的苹果酸脱氢酶突变体MDHM、来源于钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator）的甲醇脱氢酶MeDH、来源于E.coli的2-酮基-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶YfaU,多酶偶联催化丙酮酸与甲醇生产2,4-二羟基丁酸。