论文部分内容阅读
N-乙酰氨基葡萄糖是形成几丁质的基本单位,是葡萄糖的一种重要衍生物,通常以β-（1,4）糖苷键聚合而成线状多聚物——几丁质。它不仅是真菌、植物细胞的细胞壁的重要组成成分,也是人体结缔组织的基本组成单元,是人体关节中糖蛋白的重要成分。N-乙酰氨基葡萄糖具有预防骨关节疾病、抗菌消炎、促进伤口愈合等作用,因此在医药保健、食品和化妆品等领域有广泛的应用。N-乙酰氨基葡萄糖的生产主要以甲壳素为原料,甲壳质是自然界中含量仅次于纤维素的天然多糖类物质,它是由N-乙酰氨基葡萄糖经β-（1,4）糖苷键连接而成的高分子聚合物。甲壳素的分布广泛,存在于真菌、酵母等细胞的细胞壁中或是昆虫及虾蟹等的外骨骼中。虾蟹养殖在世界水产养殖领域中比重较大,我国成品虾蟹年产量超过200万吨,消费后产生的虾蟹壳总量丰富,可用作甲壳质生产原料,具有很大经济价值。N-乙酰氨基葡萄糖的生产常用化学法、物理法等方法,但其中的工艺程序涉及到浓酸、强碱的使用,不仅水资源消耗量极大,而且环境污染严重,因此,环境友好、反应条件温和的酶法分解几丁质成为了研究热点。酶法降解甲壳素制备氨基葡萄糖,具有工艺易控制、产物纯度高和得率高等优点,多种酶协同处理可提高生产效率。本文在本实验室成功异源表达Aspergillus fumigatus来源的壳聚糖酶CSN基础上,在毕赤酵母中成功了表达外切-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶NagZ和外切-β-D-氨基葡萄糖苷酶GlmATK,将其与CSN偶联,进行水解壳聚糖底物制备N-乙酰氨基葡萄糖单体的研究。具体内容如下:（1）外切-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶NagZ的克隆及在毕赤酵母中的表达:将来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的外切-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因nagZ根据酵母的密码子偏好性进行优化,然后利用Overlapping PCR的方法合成nagZ基因,并将其克隆至载体pHBM905A上,在毕赤酵母GS115中进行异源表达。经摇瓶发酵,发酵上清中最大酶活单位可达0.56U/m L。重组NagZ的酶学性质分析表明:其最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.5。同时,该酶具有较好的稳定性:在pH4.5-10的范围内,均保持80%以上的活性;将该酶置于55℃处理1h后,残余酶活仍有85%。（2）外切-β-D-氨基葡萄糖苷酶Glm ATK、CSX、GlmAPH的克隆及在毕赤酵母中的表达:将来源于嗜热古细菌Thermococcus kodakarensis KOD1的外切-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因tk利用上述方法进行序列优化后合成,构建至载体pHBM905A上在毕赤酵母中异源表达。同时,选取另外两种来源于Aspergillus sp.CJ22-326中的外切-β-D-氨基葡萄糖苷酶CSX和来源于Pseudozyma hubeiensis SY62中的外切-β-D-氨基葡萄糖苷酶Glm APH,合成其基因后,在毕赤酵母中进行异源表达。（3）外切-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶NagZ的酶解底物分析:将重组NagZ应用于几丁质及壳聚糖底物的酶解实验,分别探究重组NagZ在不同温度、时间及作用底物等条件下产生乙酰葡萄糖胺的情况,酶解结果表明,NagZ在37℃条件下酶解效果较好,1m L酶解体系中加入活力单位2U的重组NagZ发酵上清,酶解浓度为1%胶状几丁质底物及壳聚糖底物,均可产生N-乙酰氨基葡萄糖单体。将NagZ与不同酶量的CSN偶联作用于壳聚糖底物,可使底物分解,但仍需进一步优化酶解条件,大量生产N-乙酰氨基葡萄糖单体。综上所述,本研究成功在毕赤酵母中实现NagZ的异源表达,同时验证其可作用于几丁质或壳聚糖底物,酶解产生N-乙酰氨基葡萄糖单体。偶联NagZ与CSN作用于壳聚糖底物,可有效分解底物。因此本文为酶法高效生产乙酰氨基葡萄糖单体奠定了基础。