论文部分内容阅读
背景:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌最常见的病理类型,占85-90%。同时,肝细胞肝癌的发生率和死亡率均居世界前列。肝细胞肝癌由于起病隐匿、进展迅速、恶性程度高等特点,急需揭示其发病机制,提高对HCC的诊断和治疗。研究发现,许多长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)的异常表达与肝癌的发生发展过程密切相关。而lncRNA CCAT2已经被报道在多种肿瘤中扮演重要角色,但其在HCC中的作用仍未明确。目的:1.明确lncRNA CCAT2在肝细胞肝癌中的生物学功能。2.阐释CCAT2影响肝癌细胞功能的具体作用机制。3.阐释CCAT2与靶基因间具体作用关系。方法:第一部分:CCAT2在HCC细胞和组织中的表达研究1.RT-qPCR检测lncRNA CCAT2在四种肝癌细胞系(SMMC7721、Huh7、HepG2、SK-Hep1)以及正常永生化肝细胞系(L02)中的表达情况。2.进一步检测CCAT2在20对HCC病人肿瘤组织及对应癌旁组织中的RNA水平。第二部分:CCAT2在HCC中的生物学功能研究1.构建CCAT2的过表达质粒,设计并筛选针对CCAT2的干扰shRNA。通过MTS实验、克隆形成实验、transwell小室实验(铺胶/不铺胶)、划痕实验、流式细胞术等体外实验检测CCAT2对肝癌细胞系SMMC7721和SK-Hep1生物学功能的影响。2.构建CCAT2过表达及干扰稳定细胞系,通过裸鼠皮下成瘤实验和肝脏原位转移实验验证CCAT2在体内对肝癌细胞成瘤和转移的影响。第三部分:CCAT2作用靶基因筛选及靶基因生物学功能研究1.RT-qPCR筛选CCAT2作用的靶基因,并通过RT-qPCR和WB检测过表达/干扰CCAT2后靶基因表达水平的变化情况。2.RT-qPCR、WB、免疫组织化学实验(Immunohistochemistry,IHC)等技术检测靶基因NDRG1在肝癌细胞系及肝癌组织中的表达,分析HCC病例中CCAT2与NDRG1表达的相关性。3.构建NDRG1全长过表达质粒,进行一系列生物学功能实验验证NDRG1在肝癌细胞SMMC7721和SK-Hep1中的作用,并通过与CCAT2共转染后的NDRG1表达量检测及生物学功能检测探究CCAT2如何通过NDRG1在肝癌细胞中发挥作用。4.验证体内实验中,CCAT2对NDRG1表达的调控作用。第四部分:CCAT2调控靶基因NDRG1的分子机制研究1.通过NCBI数据库找到NDRG1启动子序列,构建其启动子全长的双荧光素酶报告基因质粒。通过双荧光素酶报告基因实验检测CCAT2对NDRG1启动子活性影响。2.构建NDRG1启动子截短区间的双荧光素酶报告基因质粒。通过双荧光素酶报告基因实验检测CCAT2对NDRG1启动子各个区段活性影响,确定CCAT2的活性作用区间。结果:第一部分:CCAT2在HCC细胞和组织中的表达研究1.CCAT2在四种肝癌细胞系中表达均高于正常L02细胞系。2.20对HCC组织标本中,CCAT2在肝癌组织中的表达较对应癌旁组织呈升高趋势。第二部分:CCAT2在HCC中的生物学功能研究1.CCAT2能促进肝癌细胞系SMMC7721、SK-Hep1的增殖、迁移侵袭能力。2.在裸鼠皮下成瘤和肝脏原位转移模型中,注入过表达CCAT2稳定细胞系能促进肝癌细胞的成瘤、肝脏原位转移和远处肺转移能力,干扰则相反。第三部分:CCAT2作用靶基因筛选及靶基因生物学功能研究1.过表达CCAT2能够上调NDRG1的表达,干扰则相反。NDRG1是CCAT2作用的下游靶基因。2.NDRG1在肝癌细胞系及20对HCC组织标本中表达均升高,且在临床病例中分析得到,CCAT2与NDRG1表达呈正相关。3.过表达NDRG1能促进肝癌细胞系SMMC7721、SK-Hep1的增殖、迁移侵袭能力。CCAT2能特异性调控NDRG1的表达及生物学功能。4.在小鼠体内实验中,过表达CCAT2组小鼠肿瘤组织NDRG1表达增加,干扰则相反。第四部分:CCAT2调控靶基因NDRG1的分子机制研究1.CCAT2增强NDRG1启动子的转录活性。2.CCAT2对NDRG1启动子的作用区间主要位于-1000~-500 bp区段。结论:长链非编码RNA CCAT2通过增强NDRG1启动子转录活性,使NDRG1表达增加,从而促进肝癌细胞的增殖、迁移侵袭能力。