弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病,在世界上分布广泛,大约有25%-50%的人受到感染。弓形虫的宿主非常广泛,猫科动物是其唯一的终末宿主,绝大多数温血动物均可作为该病原的中间宿主,然而不同宿主对弓形虫的易感性及转归均有不同。小鼠对其极为敏感,可引起急性的致死性感染因而常常作为弓形虫急性感染的动物模型；而鸡由于对弓形虫的感染不表现任何临床症状,被认为是不敏感的中间宿主。为了探寻这两种动物感染弓形虫后免疫病理学变化的差异,同时针对同一宿主对不同动物来源的弓形虫虫株感染后的免疫病理变化进行比较研究,特进行了如下工作：1.猫源弓形虫虫株的分离及其与鸡源、猪源和人源虫株基因型的鉴定对江苏南京地区11只家猫进行弓形虫抗体IgG的检测,筛选抗体阳性猫进行虫株的分离。利用盐酸-胃蛋白酶消化法处理阳性猫的心、脑、舌等组织,制成组织悬液腹腔接种小鼠,通过连续传代,分离到2株弓形虫虫株,分别命名为CAT2和CAT3。进而利用PCR-RFLP方法,对分离到的猫源虫株以及实验室保存的鸡源(JS)、猪源(CN)和人源(RH)共5株弓形虫虫株进行了基因型的鉴定,通过对7个等位基因5’-SAG2,3’-SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, cB21-4和L358的扩增和酶切,证明此5株弓形虫虫株均为基因Ⅰ型。2.四种不同来源弓形虫虫株对小鼠和鸡致病力的比较小鼠对弓形虫非常敏感,而鸡通常不敏感。本研究对四种不同来源的5个虫株RH, CN, JS, CAT2和CAT3对鸡和小鼠的致病力分别进行比较,同时建立弓形虫感染雏鸡的动物模型。210只10日龄雏鸡分为21个组,每组10只,5个虫株RH,CN,JS,CAT2和CAT3按照5×108,1×108,1×107,和1×106不同剂量腹腔感染10日龄雏鸡,同时设阴性对照组,仅注射生理盐水；感染后每日观察实验鸡的临床症状,逐只测量直肠温度,记录每组鸡的死亡情况；利用PCR方法对53天未死亡的鸡进行检测,对急性死亡和53天未死亡的鸡进行病理组织切片,观察病理变化。对小鼠致病力的对比试验选用腹腔感染和灌胃感染两种途径,分别选用260只ICR小鼠,随机分为26个组,每组10只,按照不同的虫株选择1×105,1×104,1×103,1×102和1×101剂量进行感染,记录每只小鼠的存活时间；根据实验动物的存活时间对5个虫株的致病力进行比较。结果发现RH,CN, CAT2和CAT3四个虫株对小鼠和鸡的致病力无显著差异,而JS株对小鼠的致病力较弱,但对鸡的致病力较强,这说明虫株的来源对弓形虫的致病性具有重要的影响。同时发现1×107剂量的速殖子腹腔感染10日龄雏鸡,既能产生适度的临床症状,又能够使实验动物避免死亡,可作为弓形虫体内感染雏鸡的动物模型。综合考虑小鼠的感染率、存活时间以及感染过程中的偶然因素,发现1×102腹腔感染和1×104灌胃感染是小鼠模型的最佳感染剂量。3.四种不同来源弓形虫虫株腹腔感染小鼠免疫病理变化的比较本实验将JS、CAT、CN和RH弓形虫虫株腹腔感染小鼠,对小鼠感染弓形虫后的免疫病理变化进行比较。200只小鼠(18。22g)随机分成5个组,每组40只,分别命名为JS, CAT, CN, RH和阴性对照组,四个虫株JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×102的剂量腹腔感染小鼠,阴性对照组仅注射PBS。感染后分别在第0天,3天,6天和8天采血和脾脏用于分离血清和脾脏淋巴细胞,每组10只。弓形虫循环抗原和特异性抗体(IgA,IgG, IgM和IgG的亚型IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3)利用ELISA方法进行检测；脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞和NK细胞以及MHC Ⅰ和MHC Ⅱ类分子的变化利用流式技术进行检测；细胞因子IFN-γ, IL-12, IL-4, IL-10和IL-17利用ELISA方法进行检测；血清铁、血清中NO和iNOS的活性利用比色法进行检测。感染后第6天能够检测到IgM并持续至第8天；感染后第8天能检测到IgA,而IgG及其亚型均未检测到；CD4+, CD8+T和NK细胞分别在第6天、第3天和第3天显著上升,均在第8天时显著下降,在此时间点仅CN组CD4+T细胞显著高于阴性对照组,4个感染组CD8+T细胞虽下降但仍显著高于阴性对照组,RH、CN和CAT组NK细胞显著高于阴性对照组；MHC Ⅰ分子第6天显著上升但在第8天时下降,仅CAT组显著高于阴性对照组；MHC Ⅱ分子从第3天显著下降并持续至第8天仍显著低于阴性对照组；IFN-γ和IL-12在第6天显著上升均在第8天时下降,4个感染组IFN-γ在第8天仍显著高于阴性对照组,但JS组IL-12与阴性对照组无差异；IL-10和IL-4在第3天显著上升均在第6天时显著下降,4个感染组IL-10仍显著高于阴性对照组,但IL-4与阴性对照组无差异；IL-17在第6天显著上升并持续至第8天仍高于阴性对照组；感染后第3天可检测到高浓度的NO、血清铁以及高活力的iNOS,均在第6天达到最高峰而后下降,第8天时,仅CAT组NO显著高于阴性对照组,4个感染组的iNOS与阴性对照组之间差异不显著,但血清铁仍显著高于阴性对照组。这些结果反应了小鼠抗弓形虫腹腔感染而引起的免疫病理学变化,而不同来源虫株之间存在的差异可能与虫株的生物学特性有关,说明虫株的来源对弓形虫免疫病理变化也具有重要的影响。4.四种不同来源弓形虫虫株灌胃感染小鼠免疫病理变化的比较本实验将JS、CAT、CN和RH弓形虫虫株灌胃感染小鼠,对小鼠感染弓形虫后的免疫病理变化进行比较。250只小鼠(18-22g)随机分成5个组,每组50只,分别命名为JS、CAT、CN、RH和阴性对照组,四个虫株JS、XAT、CN和RH的速殖子按1×104的剂量灌胃感染小鼠,阴性对照组仅灌服等量PBS。感染后分别在第0天,3天,6天,8天和10天采血和脾脏用于分离血清和脾脏淋巴细胞,每组10只。弓形虫循环抗原和特异性抗体(IgA、IgG、IgM和IgG的亚型IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)利用ELISA方法进行检测；脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞和NK细胞以及MHCI和MHCⅡ类分子的变化利用流式技术进行检测；细胞因子IFN-γ， IL-12, IL-4, IL-10和IL-17利用ELISA方法进行检测；血清铁、血清中NO和iNOS的活性利用比色法进行检测。感染后第6天TCA阳性并持续至第10天；第10天时IgG显著上升并以IgG2a和IgG2b为主；IgA和IgM第6天时显著上升并持续至第10天；CD4+和CD8+T细胞第6天时开始显著上升,第8天达到高峰,各组CD4+T细胞在第10天下降,与阴性对照组无差异,而CD8+T细胞虽下降,但CN、CAT和JS仍显著高于阴性对照组；弓形虫感染后第3天,JS和CAT组NK细胞水平显著上升,第8天时,四个感染组均上升并持续至第10天；CAT组MHCI水平第3天显著上升,其余三个感染组无显著变化,第8天,四个感染组均显著上升,第10天时开始下降,但除JS组外,其余三个感染组仍显著高于阴性对照组；MHC Ⅱ分子在第3天显著下降并持续至第10天；感染后第6天,JS和CAT感染组组IFN-γ显著上升,第8天时,RH、CN和JS三个组显著上升,但CAT组下降,第10天时4个感染组均下降与阴性对照组无差异；RH和CAT组IL-12在感染后第3天显著上升,第6天时四个感染组均显著上升并持续至第8天,第10天时开始下降仅CAT组显著高于阴性对照组；RH和CAT组IL-4仅在第6天时显著上升；CN、JS和CAT组IL-17在第8天时显著上升而后开始下降,第10天时仅JS组显著高于阴性对照组；NO、血清铁和iNOS勺活力均在第3天开始显著上升并持续至第8天,第10天时下降与阴性对照组之间无差异。这些结果反应了小鼠弓形虫灌胃感染所引起的免疫病理变化。与腹腔感染小鼠相比,较晚出现的TCA,较早出现并且较高滴度的IgA以及产生的IgG说明腹腔感染和灌胃感染两种不同的感染途径影响免疫病理变化的产生。5.四种不同来源弓形虫虫株腹腔感染鸡免疫病理变化的比较本实验将JS、CAT、CN和RH弓形虫虫株腹腔感染雏鸡,对鸡感染弓形虫后的免疫病理变化进行比较。300只10日龄雏鸡随机分成5个组,每组60只,分别命名为JS,CAT, CN, RH和阴性对照组,JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×107的剂量腹腔感染雏鸡,阴性对照组仅注射PBS。感染后分别在第0天,4天,11天,25天,39天和53天采血和脾脏,分离血清和脾脏淋巴细胞,每组取10只。弓形虫循环抗原和特异性的抗体(IgA,IgG和IgM)利用ELISA方法进行检测；脾脏淋巴细胞中CD4+,CD8+以及MHC Ⅰ和MHC Ⅱ类分子的变化利用流式技术进行检测；细胞因子IFN-γ,IL-12,IL-4,IL-10和IL-17利用ELISA方法进行检测；血清铁、血清中NO和iNOS的活性利用比色法进行检测；血细胞包括中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞利用血细胞分析仪直接测定。感染组高水平的IgM,IgG和IgA分别在感染后第4天,第11天和第11天出现,并持续至39、53和39天；不同感染组CD4+T细胞分别在第4天和第11天显著上升,至53天时与阴性对照组无显著差异；CD8+T细胞和MHC Ⅰ类分子在第4天显著上升,至53天时,CD8+T细胞仍显著高于阴性对照组,而MHC Ⅰ类分子在39天时与阴性对照组差异不显著；MHC Ⅱ类分子在第4天显著上升又在25天时显著下降,至53天时与阴性对照组差异不显著；IFN-γ, IL-12, IL-10和IL-17分别在感染后第4天显著上升,25天时,感染组IFN-γ和IL-10与阴性对照组差异不显著,而感染组IL-12至53天时仍显著高于阴性对照组,IL-17则无显著差异；4个感染组IL-4自始至终均无显著变化；感染组NO,血清铁以及iNOS的活力在第4天显著上升,又在第39天后与阴性对照组无显著差异。这些都反应了鸡感染弓形虫后的免疫病理学变化。与另外三个感染组相比,JS组具有更高水平的CD4+, CD8+T细胞,IFN-γ, IL-12, IL-10,NO和更高活力的iNOS,这说明其差异可能与虫株的来源有关。与腹腔感染小鼠的结果相比,IgG抗体的产生,感染早期显著上升的MHC Ⅱ,较早产生的IFN-γ, IL-12和IL-17以及无显著变化的IL-4有可能是造成鸡和小鼠对弓形虫易感性差异的原因,其确切机制仍需进一步研究。