癌症作为威胁人类健康的重大疾病具有免疫抑制和免疫逃逸特性。传统的治疗手段如化疗和放疗常常面临毒副作用大、易发生耐受、易复发的问题。免疫疗法旨在激活自身的免疫系统以对抗癌症,其具有无毒副作用、复发率低、预后好等优势,是目前公认的一种很有前途的癌症治疗方法。由于肿瘤部位存在的免疫抑制微环境常常保护肿瘤细胞逃避免疫系统攻击,因此克服肿瘤相关免疫抑制对肿瘤免疫疗法至关重要。一系列核酸类药物可通过多种途径逆转肿瘤免疫抑制及免疫逃逸。但核酸药物自身易被血液、组织和细胞内复杂生理环境降解,因此制备具有高效且安全的核酸传递载体具有重大意义。本论文设计、制备了一系列高效核酸递送载体将多种核酸治疗剂靶向传递到特定细胞以逆转肿瘤免疫抑制和免疫逃逸。载体基于天然高分子和碳酸钙这些具有理想的生物相容性和生物降解性的材料,具有安全性高的优势。研究了核酸治疗剂传递体系在核酸递送、激活抗肿瘤免疫和逆转抗肿瘤免疫抑制方面的性能。在第一章中,概述了核酸递送载体的研究现状以及肿瘤微环境中存在的免疫抑制因素和其逆转策略,也介绍了靶向核酸递送系统,说明了本文的选题思路。在肿瘤微环境中,受到肿瘤免疫抑制因素的作用,免疫细胞中的巨噬细胞主要为抑制抗肿瘤免疫的M2表型。针对这一问题,在第二章中,制备了有效递送免疫佐剂未甲基化腺嘌呤胞嘧啶寡脱氧核苷酸（Cp G ODN,简称ODN）的功能化纳米体系甘露糖化羧甲基壳聚糖/硫酸鱼精蛋白/碳酸钙/ODN（MCMC/PS/Ca CO3/ODN）,来活化巨噬细胞从而激活抗肿瘤免疫应答。多功能载体中的组分（包括赋予纳米粒子巨噬细胞靶向能力的MCMC,提高ODN负载能力和增强细胞摄取的PS,以及用于包封ODN并诱导有利p H敏感性的Ca CO3）均通过自组装引入载体中。研究了ODN递送体系对巨噬细胞（RAW 264.7细胞）的免疫激活能力。结果显示,与未功能化传递体系相比,MCMC/PS/Ca CO3/ODN纳米粒子借助于甘露糖介导的内吞作用而表现出更高的ODN递送效率和更强的免疫刺激能力。MCMC/PS/Ca CO3/ODN纳米粒子可调节RAW 264.7细胞的核因子-κB（NF-κB）活性而诱导其大量分泌促炎细胞因子,包括白介素-12（IL-12）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,且M1表型标志物CD80的表达显著提高,表明RAW264.7细胞的极性被成功调节至M1抗肿瘤型。在第三章中,制备了巨噬细胞双靶向纳米粒子甘露糖化羧甲基壳聚糖/透明质酸/硫酸鱼精蛋白/ODN（MCMC/HA/PS/ODN）将Cp G ODN更高效地递送至巨噬细胞以克服肿瘤相关免疫抑制。为了赋予多重的巨噬细胞靶向功能,在传递体系中同时引入了具有巨噬细胞靶向功能的MCMC和HA,并且利用PS复合ODN以形成正电性的纳米核心,随后再通过静电作用将带负电的靶向组分MCMC和HA组装到PS/ODN的表面形成巨噬细胞双靶向纳米粒子。研究了ODN递送系统对巨噬细胞（J774A.1细胞）的免疫激活能力。结果表明,相比于单靶向或无靶向的纳米粒子,双靶向纳米粒子可将ODN更高效地传递到J774A.1细胞,具有更好的免疫刺激活性,能更高效地调控J774A.1细胞的极性,将其转变为M1抗肿瘤表型。另外,研究了递送系统对肿瘤细胞（MCF-7细胞）的影响。在MCF-7细胞中,观察到NF-κB、磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3R3）以及磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）表达增加,表明NF-κB和PI3K/AKT通路被活化,这可能引起肿瘤细胞的增殖;但另一方面MCF-7细胞中凋亡相关因子（Factor associated suicide,Fas）与凋亡相关因子配体（Factor associated suicide ligand,Fas L）的表达上调,可诱发Fas/Fas L通路导致的细胞凋亡。虽然实验结果表明ODN传递系统对MCF-7细胞生长无显著影响,但由于ODN对于肿瘤细胞的作用是复杂且多效的,因此将Cp G ODN特异性递送至巨噬细胞是十分重要的。在第四章中,为了更高效地调节巨噬细胞极性至M1抗肿瘤表型,通过自组装制备了多功能化基因递送系统融合肽/透明质酸/硫酸鱼精蛋白/碳酸钙/DNA（Peptide/HA/PS/Ca CO3/DNA,PHNP）用于递送编码IL-12基因的质粒DNA（p DNA IL-12）以再极化巨噬细胞和逆转肿瘤免疫抑制。递送系统中引入的与Fc受体（Fc receptors）和神经毡蛋白-1（Neuropilin-1）有特异亲和力的具有促吞噬素序列的融合肽（Peptide）和可与CD44特异性结合的HA赋予了载体巨噬细胞双靶向功能。结果显示,PHNP借助于融合肽和HA介导的内吞作用而对J774A.1细胞提供了比其他递送体系更有效的免疫调节作用。PHNP转染的J774A.1细胞能产生最高水平的抗肿瘤因子IL-12,与此同时能最有效地抑制抗炎细胞因子如白介素-10（IL-10）和白介素-4（IL-4）的分泌;另外,PHNP转染的J774A.1细胞中M1抗肿瘤表型的标志物（CD80和i NOS）的表达显著上调、而M2型标志物（CD206和Arg-1）表达显著下调,这些结果说明PHNP能高效地将J774A.1巨噬细胞由M2促肿瘤型转变为M1抗肿瘤型,成功地克服了免疫抑制。对于肿瘤细胞（He La细胞）,PHNP转染的He La细胞除了大量分泌高水平IL-12外,其免疫抑制分子CD47的表达明显下调,而免疫共刺激分子CD80（Cluster of differentiation 80,B7-1）和人类白细胞抗原-1（Human leukocyte antigen-1,HLA-1）的表达显著上调,表明PHNP可有效地利用肿瘤细胞生产激活免疫的IL-12、并同时逆转肿瘤介导的免疫抑制。肿瘤微环境的免疫抑制归根结底由肿瘤细胞自身引起,如表达的免疫抑制分子比如程序性细胞死亡配体-1（Programmed death-ligand 1,PD-L1）和CD47（Cluster of differentiation 47）等,肿瘤细胞存在多条分子通路涉及PD-L1表达,其中主要包括Wnt/β-catenin通路。基于以上研究背景,为了逆转肿瘤诱导的免疫抑制和免疫逃逸,在第五章中制备了多功能化递送系统AS1411适配子功能化透明质酸/TAT-NLS融合肽功能化透明质酸/硫酸鱼精蛋白/碳酸钙/质粒（AHA/PHA/Ca CO3/PS/Plasmid）将CRISPR-Cas9基因编辑质粒递送至肿瘤细胞核,以准确有效地敲除编码β-连环蛋白（β-catenin）的CTNNB1基因。通过非共价作用引入的AHA和PHA赋予了载体肿瘤细胞/细胞核靶向、跨膜和核转运功能。研究了基因编辑质粒递送系统对肿瘤细胞（H1299细胞）的作用。结果显示,由于AS1411介导的肿瘤细胞及细胞核靶向和TAT-NLS的细胞穿透作用和核定位作用,AHA/PHA/Ca CO3/PS/Plasmid处理的细胞中基因编辑质粒的摄取和核转运明显增加。基因编辑效果分析显示,相比于未功能化及单功能化纳米粒子,多功能化纳米粒子能更有效地敲除CTNNB1基因从而更明显地下调β-catenin的表达。另外,下调β-catenin可以有效地抑制Wnt/β-catenin通路活性,显著抑制下游蛋白（cyclin-D1、VEGF、Bcl-2和PD-L1等）的表达。而且编辑后的H1299细胞中,细胞凋亡比例增加、细胞生存率降低。更重要的是,在编辑后的H1299细胞中,PD-L1/PD-1的结合明显受阻,H1299细胞与毒性T细胞共培养免疫应答实验表明效应T细胞对癌细胞的特异性杀伤力明显增强。以上结果证明基因编辑多功能传递系统能通过敲除CTNNB1基因有效逆转PD-L1/PD-1刹车介导的肿瘤免疫逃逸。Wnt/β-catenin通路除了参与肿瘤免疫行为的调节,还涉及肿瘤其它行为的调节,包括肿瘤生长、迁移和侵袭以及干性相关特性。在第六章中,制备了用于递送靶向β-catenin的基因编辑质粒的多功能递送系统AS1411适配子功能化羧甲基壳聚糖/TAT肽官能化羧甲基壳聚糖/硫酸鱼精蛋白/碳酸钙/质粒（ACMC/TCMC/PS/Ca CO3/Plasmid,ATNP）以重新调节肿瘤细胞特性。在递送系统中,基因编辑质粒与具有膜和核转运活性的PS结合并与Ca CO3共沉淀以得到PS/Ca CO3/Plasmid纳米核心,进一步通过自组装引入ACMC和TCMC以得到多功能递送系统ATNP。研究了基因编辑质粒递送系统对肿瘤细胞（Hela细胞）的作用。结果表明,由于AS1411具有肿瘤细胞及细胞核靶向以及TAT引起的内吞增强,ATNP能高效地将CRISPR-Cas9质粒递送至肿瘤细胞核,实现了有效的基因编辑,敲除了编码β-catenin的CTNNB1基因。更重要的是,β-catenin的下调可以有效地阻止其在细胞核中的富集,从而下调Vimentin,Snail,MMP-2,MMP-9,CD44,Nanog和Oct4等蛋白质的表达,抑制细胞增殖和转移。编辑的肿瘤性Hela细胞的恶性化得到有效控制,包括抑制生长,抑制迁移和侵袭,以及降低肿瘤干性等。