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巴贝虫是一种寄生于人或其他哺乳动物红细胞内经媒介蜱叮咬传播的顶复门原虫,可引起人兽共患巴贝虫病。巴贝虫感染多呈隐匿性,亦可引起不同程度的自发性溶血疾病,在老年人或免疫功能低下的患者临床症状明显,重症患者可危及生命。田鼠巴贝虫是引起输血途径感染巴贝虫病的主要虫种,且经输血途径引起的巴贝虫病致死率更高。目前巴贝虫病常用治疗药物是克林霉素和奎宁,阿托伐醌和阿奇霉素可作为二线药物,以上药物为提高疗效可联合使用,但毒性较大,且对于重症患者可能由于阿托伐醌-阿奇霉素耐药性的出现而使药物治疗不能奏效。因此,筛选设计安全有效的疫苗对巴贝虫病的预防具有重要意义。第一部分田鼠巴贝虫裂殖子表面蛋白筛选、克隆表达及抗原性分析目的:田鼠巴贝虫裂殖子表面蛋白44（Babesia microti merozoite surface protein 44,BmSP44）的筛选功能预测及其重组蛋白克隆表达优化、细胞定位并检测其对田鼠巴贝虫不同感染时期血清的抗原性。方法:1)利用生物信息软件分析预测田鼠巴贝虫裂殖子分泌蛋白结合前期蛋白芯片结果,筛选得到田鼠巴贝虫裂殖子表面蛋白BmSP44。通过PCR技术扩增BmSP44的基因片段,原核表达纯化得到重组蛋白BmSP44（rBmSP44）,分别用考马斯亮蓝染色和Western Blot验证其分子量大小。2)体外培养田鼠巴贝虫,至虫浓度较高时收集巴贝虫培养液,采用IFA法观察BmSP44在红细胞内的定位情况。3)ELISA法评价rBmSP44对不同感染时期小鼠血清的免疫反应。结果:1)从田鼠巴贝虫基因组数据库中筛选得到55个分泌性蛋白并结合蛋白芯片结果,得到候选分子BmSP44表面蛋白,该蛋白预测分子量大小为24kDa,含1个跨膜区、存在信号肽剪切位点以及抗原表位。通过分子克隆构建了重组质粒pGEX-6p-2-BmSP44,原核表达纯化后获得重组蛋白BmSP44。2)IFA法实验显示rBmSP44主要定位在田鼠巴贝虫细胞膜和感染红细胞的细胞质中,与预测该蛋白为分泌性蛋白特性一致。3)ELISA法检测该蛋白与感染1W、2W和3W田鼠巴贝虫小鼠血清特异性结合显示较强的免疫反应,与前期蛋白芯片结果一致。结论:利用生物信息软件分析预测田鼠巴贝虫裂殖子表面蛋白的分子特性,含有信号肽剪切位点且具有抗原活性。成功克隆表达纯化得到rBmSP44,分子量为24kDa。IFA显示该蛋白为裂殖子表面蛋白,与生物信息预测结果相同。ELISA结果分析rBmSP44能识别感染田鼠巴贝虫不同时期血清,可作为诊断巴贝虫病的候选抗原。第二部分田鼠巴贝虫裂殖子表面蛋白在巴贝虫病小鼠模型中的功能鉴定目的:rBmSP44抗血清被动免疫和rBmSP44蛋白主动免疫后对小鼠感染田鼠巴贝虫免疫保护力评价及其诱导相关免疫应答特征。方法:1)rBmSP44蛋白兔源性多克隆抗体（200μl）和正常兔血清（200μl）腹腔注射BALB/c小鼠体内后24h分别攻击感染田鼠巴贝虫,感染后第3天、第6天、第9天外周血涂片和qRT-PCR检测田鼠巴贝虫虫浓度与虫载量以及小鼠体重、体温变化趋势,同时用高铁氰化钾法检测血红蛋白浓度变化。2)rBmSP44蛋白（20μg）和等量弗氏完全佐剂首次主动免疫BALB/c小鼠,第二次和第三次分别使用40μgrBmSP44蛋白与等量弗氏不完全佐剂主动免疫小鼠,共免疫三次,末次免疫后1周测血清中rBmSP44蛋白抗体滴度评价主动免疫效果。免疫成功小鼠攻击感染田鼠巴贝虫,血涂片染色镜检结合实时荧光定量PCR检测田鼠巴贝虫感染情况,同时观察小鼠体重、体温和血红蛋白浓度变化。3)ELISA法检测感染田鼠巴贝虫后第3、6、9天免疫组小鼠血清中细胞因子的水平变化,评价rBmSP44诱导的免疫应答特点。结果:1)被动免疫实验两组小鼠攻击感染后分别在第3、6、9天的血涂片计数iRBC百分率,rBmSP44抗血清被动免疫组（n=3）分别为（12.67±1.45）%、（60.33±2.60）%和（28.00± 1.16）%而正常兔血清对照组（n=3）的虫浓度分别为（17.33±0.88）%、（69.67±0.88）%和（34.33±1.20）%,rBmSP44 抗血清组小鼠外周血虫浓度低于正常兔血清组（*P＜0.05）。qRT-PCR鉴定小鼠外周血中巴贝虫18s核糖体与小鼠GAPDH拷贝数相对比值,结果显示rBmSP44抗血清被动免疫组小鼠在感染田鼠巴贝虫第3、6、9天的巴贝虫相对虫载量低于正常兔血清组（*P＜0.05,***P＜0.001）,与血涂片虫浓度计数一致。此外,分别在未感染田鼠巴贝虫和第3、6、9天收集小鼠外周血,检测不同时间点小鼠血红蛋白浓度,结果显示rBmSP44抗血清被动免疫组（n=3）小鼠血红蛋白浓度分别为（87.88±8.60）g/L、（104.2±5.74）g/L、（73.17±8.28）g/L、（65.82±6.26）g/L,正常兔血清对照组（n=3）血红蛋白浓度分别为（108.8±10.91）g/L、（93.27±1.73）g/L、（66.8±7.46）g/L、（37.51±3.61）g/L,提示在不同感染时期rBmSP44抗血清免疫组小鼠外周血血红蛋白浓度均高于正常兔血清组（*P＜0.05）。而在未感染田鼠巴贝虫和第3、6、9天rBmSP44抗血清组（n=3）小鼠体重分别为（19.34±0.44）g、（18.37±0.46）g、（17.53±0.25）g、（16.98±0.31）g,正常兔血清组（n=3）体重分别为（19.67±0.0.43）g、（18.04±0.27）g、（17.40±0.23）g、（16.85±0.18）g,两组小鼠体重变化无明显差异。同时在未感染田鼠巴贝虫和第3、6、9天rBmSP44抗血清免疫组小鼠体温分别为（36.63±0.13）℃、（34.5±0.21）℃、（33.9±0.36）℃、（33.8±0.61）℃,正常兔血清对照组体温分别为（36.2±0.35）℃、（35.0±0.31）℃、（34.2±0.40）℃、（33.87±0.72）℃,两组体温变化无明显差异。2)主动免疫两组小鼠分别在攻击感染后第3、6、9天小鼠外周血血涂片计数iRBC 百分率,rBmSP44 免疫组（n=5）虫浓度分别为（13.4±1.08）%、（63.4±2.90）%和（26.0±1.41）%,佐剂对照组（n=5）的虫浓度分别为（20.2±1.28）%、（75.2±1.72）%和（33.4±1.21）%,提示rBmSP44蛋白主动免疫组小鼠外周血虫浓度低于佐剂组（**P＜0.01）。qRT-PCR鉴定小鼠外周血中巴贝虫18s核糖体与小鼠GAPDH拷贝数相对比值,结果显示rBmSP44蛋白免疫组小鼠在感染田鼠巴贝虫第3、6、9天巴贝虫虫体载量低于佐剂组（***P＜0.001）。同时,分别在未感染田鼠巴贝虫和第3、6、9天收集的小鼠外周血进行血红蛋白浓度检测,结果显示rBmSP44 蛋白免疫组（n=5）分别为（122.1±9.02）g/L、（94.20±1.93）g/L、（65.97±2.55）g/L、（53.10±1.32）g/L,而佐剂对照组（n=5）血红蛋白浓度分别为（127.7±3.49）g/L、（80.31±3.02）g/L、（47.29±1.80）g/L、（40.52±1.63）g/L,提示不同感染时期rBmSP44蛋白免疫组小鼠外周血中血红蛋白浓度均高于佐剂组（**P＜0.01,***P＜0.001）。在未感染田鼠巴贝虫和攻击感染后第3、6、9天rBmSP44蛋白免疫组（n=5）小鼠体重分别为（22.10±0.84）g、（21.38±0.79）g、（20.78±0.85）g、（20.50±0.78）g,佐剂组（n=5）体重分别为（21.58±0.52）g、（21.14±0.49）g、（20.68±0.48）g、（20.04±0.45）g,免疫组与佐剂对照组体重变化无明显差异。在未感染田鼠巴贝虫和第3、6、9天,rBmSP44蛋白免疫组（n=5）体温分别为（36.82±0.15）℃、（36.74±0.17）℃、（36.2±0.10）℃、（36.04±0.13）℃,佐剂组（n=5）体温分别为（37.44±0.25）℃、（37.72±0.10）℃、（37.12±0.30）℃、（36.44±0.22）℃,显示rBmSP44蛋白免疫组小鼠在第3天和第6天的体温略低于佐剂组（*P＜0.05,**P＜0.01）。3)ELISA法检测攻击感染后第3、6、9天中rBmSP44蛋白免疫组（n=5）细胞因子 IFN-y浓度分别为（49.51±1.71）pg/ml、（352.6±30.56）pg/ml、（44.12±2.33）pg/ml,佐剂对照组（n=5）分别为（47.58±2.27）pg/ml、（70.21±8.75）pg/ml、（39.65±0.73）pg/ml,表明免疫组小鼠在田鼠巴贝虫感染第6天产生的IFN-γ明显高于佐剂组（***P＜0.001）;在攻击感染后第3、6、9天中rBmSP44蛋白免疫组（n=5）小鼠血清中细胞因子IL-10浓度分别为（63.60±3.81）pg/ml、（206.3±32.14）pg/ml、（38.09±2.23）pg/ml,佐剂对照组（n=5）分别为（54.86±2.19）pg/ml、（102.7±10.82）pg/ml、（29.44±0.74）pg/ml,提示免疫组小鼠在田鼠巴贝虫感染第6天和第9天的IL-10浓度明显高于佐剂组（*P＜0.05）。而在攻击感染后第3、6、9天中rBmSP44蛋白免疫组（n=5）小鼠血清中细胞因子TNF-α浓度分别为（61.49±3.63）pg/ml、（64.71±6.87）pg/ml、（68.67±6.17）pg/ml,佐剂组（n=5）分别为（58.0±1.67）pg/ml、（52.44±1.04）pg/ml、（59.26±1.75）pg/ml,数据显示免疫组小鼠在第6天和第9天中TNF-α浓度略高于佐剂组。结论:通过被动免疫和主动免疫两种免疫方法评价rBmSP44蛋白对田鼠巴贝虫入侵红细胞过程的影响,结果显示rBmSP44被动免疫血清和主动免疫蛋白抗体均可部分抑制田鼠巴贝虫对红细胞的入侵,同时,ELISA法检测细胞因子显示rBmSP44蛋白较佐剂对照组可诱导小鼠产生较高的IFN-γ、IL-10和TNF-α,呈现Th1/Th2混合性免疫应答进而抑制田鼠巴贝虫的入侵。综上,田鼠巴贝虫表面蛋白rBmSP44可诱导一定的免疫保护力,具有一定开发为巴贝虫病防治疫苗靶标的潜力。