中性蛋白酶是人类最早发现的蛋白酶制剂之一,广泛的应用于了食品工业、医学治疗、皮革业以及洗涤业等领域。中性蛋白酶作为一种内切蛋白酶,最适作用pH位于6.0-7.5之间,可以使蛋白质大分子水解成短肽和氨基酸。目前市场上应用的蛋白酶来源中以细菌蛋白酶最多,通过采用生物工程技术,微滤、超滤膜分离及真空冷冻干燥技术,中性蛋白酶产品质量可达到食品级和医药级的标准。米曲霉是广泛用于传统亚洲食物如米酒,酱,豆瓣酱的生产及大量水解酶如淀粉酶和蛋白酶分泌的一种真菌。米曲霉被认为是安全的微生物,用于在食品工业生产蛋白酶。米曲霉来源的蛋白酶在植物蛋白如大豆的水解作用上显示了高效能。最近报道,与商业碱性蛋白酶,复合蛋白酶以及木瓜蛋白酶相比,从米曲霉中提取的粗蛋白酶,对花生粕蛋白有更高的水解作用。另外,与其他水解产物相比,其水解产物有更好的感官体验。为获得实用且有特征性的高产量的米曲霉蛋白酶,基因工程技术被用来重组表达这些蛋白。在米曲霉蛋白酶中,有两种金属中性蛋白酶,中性蛋白酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅱ。二者都属于锌依赖型的金属内肽酶类。本实验研究米曲霉3.042来源的重组中性蛋白酶Ⅰ在毕赤酵母中的高水平表达,改变基因原始序列并用Overlapping PCR合成,克隆到带有dl+2×201 A0X1启动子和MF4I前导肽的PHBM905BDM。电转入毕赤酵母GS115中,酪素平板法筛选出高表达的中性蛋白酶。5L发酵罐高密度发酵米曲霉来源中性蛋白酶,最高蛋白表达量可达12.87 mg/ml,最高酶活49000U/m,因而中性蛋白酶Ⅰ可以应用于工业化大生产。摇瓶中米曲霉来源中性蛋白酶的蛋白浓度为1.017mg/ml,其酶活力为1266.64 U/ml。重组中性蛋白酶I的理学性质研究如下,最适温度和pH值分别为55℃和8.0。有报道称中性蛋白酶在广泛的pH值和温度范围有高酶活,本文中最适合pH范围为7.0-9.0,在这个范围内还保有80%的酶活。最适合温度范围为45-55℃,同样在这个范围内还保有80%的酶活。以前有文章报道中性蛋白酶是锌依赖性蛋白酶,因而对EDTA很敏感,本实验结果表明低浓度Zn2+对酶活有抑制作用,而高浓度则为抑制作用。EDTA几乎完全抑制其酶活;Cu2+、Fe2+和Co2+同样抑制NPI活性;Ca2+、Mg2+和PMSF对酶的活性有一定的激活作用;而Mn2+使酶的相对活力略有降低。结果还表明该重组蛋白酶比活力为3600 U/mg,纯化后则为2600 U/mg,这可能是由于纯化后去除了 Ca2+和Mg2+。实验结果中,中性蛋白酶I的氨基酸序列及多种理化性质与噬热蛋白酶相似,因而推断二者同属于噬热蛋白酶家族。