研究背景和目的:结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病,仍是全球关注的重要公共卫生问题之一。宿主免疫在机体抵抗结核病方面起着重要的作用,大量研究表明,Th1/Th2失衡与结核病发生发展有关,同时,有报道宿主内多条信号通路在机体内分枝杆菌持续感染中起到至关重要的作用。Notch信号通路是一种进化保守的信号机制,大量研究表明,其参与调控T细胞功能和Th细胞的分化,且其配体不同诱导CD4~+T细胞分化的方向也不同,但是结论一直存在争议。因此,本实验研究Notch受体、配体和靶基因Hes1在结核分枝杆菌感染患者中基因和蛋白水平的表达及与TB患者中Th1/Th2失衡是否相关?γ-分泌酶抑制剂(DAPT)、特异性RNA干扰下调或者NICD1基因表达质粒上调Notch信号通路,观察Th1和Th2细胞及相关特征性转录因子和细胞因子表达,及细胞凋亡和增殖情况,了解Notch信号通路在结核病的发生发展中的作用。通过分析DCs上Jagged2配体是否调控TB患者T细胞免疫应答反应,探讨阻断Notch信号通路在结核病辅助治疗中的可行性,为将来进行靶向治疗提供新的思路,为其成为潜在结核病治疗策略提供实验基础。方法:1)采用实时荧光定量PCR法观察TST-、LTBI和TB组PBMCs中Notch信号通路受体1-4、配体Jagged1-2和下游靶基因Hes1mRNA水平的表达差异;2)采用Western Blotting法分析TST-、LTBI和TB组PBMCs中Notch受体Notch1,配体Jagged2和下游靶基因Hes1蛋白水平的表达差异;3)采用免疫组织化学法分析健康对照组(HC组)和TB组肺组织中Notch信号通路Notch1、Jagged2和下游靶基因Hes1蛋白水平的表达及细胞定位差异;4)应用流式细胞术法分析TST-、LTBI和TB组外周血Th1和Th2细胞表达,再进行Notch1、Jagged2和Hes1分别与Th1和Th2细胞占CD4~+T细胞比例相关分析;5)应用实时荧光定量PCR检测TB患者抗痨治疗前后PBMCs中Notch1、Jagged2和下游靶基因Hes1 mRNA表达,比较治疗前后三者的表达变化情况;6)不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)DAPT处理TST-、LTBI和TB组PBMCs,实时荧光定量PCR和Western Blotting法检测Hes1表达情况;7)流式细胞术法检测IFN-γ和IL-4,分析Th1和Th2细胞占CD4~+T细胞比例在DAPT处理前、后的变化;实时荧光定量PCR法检测GATA3和T-bet mRNA,CBA法分析细胞培养上清液中IFN-γ、IL-10和IL-4浓度;8)不同DAPT浓度阻断Notch信号通路,通过显微镜观察计数PBMCs数量,流式细胞术法验证细胞凋亡情况,CCK8检测细胞增殖情况;9)用siRNA干扰或者NICD1基因表达质粒调节Notch信号通路,检测培养上清液IL-4表达;10)应用磁珠分选法分离TB患者外周血DCs细胞,实时荧光定量PCR法检测ESAT-6刺激前后DCs细胞Jagged1-2 mRNA表达情况;11)应用磁珠分选法分离TB患者外周血CD4~+T细胞与DCs共培养,DAPT阻断Notch信号通路,CBA法检测培养上清液中Th1和Th2相关细胞因子表达;12)Jagged2-Fc与CD4~+T细胞共培养,CBA法检测培养上清液Th1和Th2细胞相关细胞因子表达情况,实时荧光定量PCR法检测GATA3和T-bet mRNA表达情况;13)通过RNA干扰特异性减少与ESAT-6共培养DCs上Jagged2基因表达,分别用实时荧光定量PCR和Western Blotting法检测RNA干扰后DCs上Jagged2mRNA和蛋白质表达水平;14)siRNA-Jagged2与TB患者CD4~+T细胞共培养,流式细胞术法检测Th1和Th2细胞占CD4~+T细胞比例,实时荧光定量PCR法检测GATA3和T-bet mRNA表达;15)统计方法:等级资料采用秩和检验,计量资料采用方差检验,计数资料采用卡方检验,多组间两两比较等级资料的统计均采用秩和检验,多组数据组间两两比较采用非参数检验中的kruskal-wallis检验法。相关性分析采用Spearman法等级相关法检验。使用SPSS19.0统计软件进行运算,以α=0.05为检验水准(双侧)。结果:1)TB患者PBMCs中Notch信号通路配体Jagged2、受体Notch1-4和下游靶基因Hes1 mRNA表达水平均高于LTBI和TST-组,而Jagged1在三组之间表达差异无统计学意义,TB组4种Notch受体中Notch1表达水平增高倍数比其他三个受体高。2)WB法验证了TB患者PBMCs中Notch1、Jagged2和Hes1蛋白表达水平均高于LTBI和TST-组。3)免疫组织化学结果提示在人肺组织中Notch信号通路受体Notch1和配体Jagged2主要表达于淋巴细胞胞浆,且TB组肺组织中的表达明显强于HC组;下游靶基因Hes1主要表达于TB组淋巴细胞的胞核和胞浆,而健康对照组肺组织中仅有少量表达于淋巴细胞胞浆中。TB患者Notch1、Jagged2和Hes1表达均高于健康对照组;4)TB患者外周血Th2细胞占CD4~+T细胞比例升高,Th1细胞比例变化不明显,存在Th1/Th2比例失衡,并且Notch1、Jagged2和Hes1分别与Th2细胞正相关,而与Th1细胞不相关;5)与TB患者抗痨治疗前相比,治疗后TB患者PBMCs中Notch1、Jagged2和Hes1表达明显下调;6)DAPT处理TST-、LTBI和TB组PBMCs后Hes1基因和蛋白表达水平,说明DAPT可有效阻断Notch信号通路,为下一步研究奠定基础;7)TB患者PBMCs DAPT处理后,Th2细胞的百分比随着剂量依赖性减少,Th1细胞没有显著变化,DAPT减少TB患者异常升高的Th2细胞和恢复Th1/Th2平衡;8)DAPT处理TB患者PBMCs前IL-4水平显著增加,而IL-10和IFN-γ浓度均变化不大,治疗后IL-4的分泌呈剂量依赖性降低,说明DAPT可以降低TB培养上清液IL-4表达,而不是IFN-γ和IL-10;9)TB患者DAPT处理前GATA3 mRNA表达较高,处理后TB患者GATA3 mRNA表达和GATA3/T-bet比例成剂量依赖性降低,进一步确定在DAPT存在下,TB患者降低的Th2细胞与IL-4和GATA3表达水平相关;10)TST-和LTBI组细胞数均随着DAPT剂量增加剂量依赖性降低,而TB患者在DAPT为10μmol/L时细胞数量减少明显,在20μmol/L DAPT时细胞数量反而明显增加。总之,DAPT可以增加细胞凋亡但不影响细胞增殖;11)siRNA干扰下调NICD1基因表达质粒上调Notch信号通路,进一步证实Notch信号通路参与对Th2细胞调控;12)ESAT-6刺激TB患者DCs细胞Jagged2表达明显上调,DAPT阻断Notch信号通路,CD4~+T细胞与DCs共培养上清液中Th2相关细胞因子IL-4、IL-5和IL-13表达明显降低,而IFN-γ变化不明显;13)Jagged2-Fc影响TB患者的CD4~+T细胞应答,促使Th2细胞相关细胞因子和特征转录因子表达上调,但对Th1细胞相关细胞因子和特征转录因子表达影响不明显;14)siRNA干扰下调DCs Jagged2基因表达,降低Th2细胞、IL-4和GATA3表达,对Th1细胞、IFN-γ和T-bet作用不明显。结论:1)TB患者体内确实存在Notch信号通路活化,经抗痨治疗后TB患者的Notch信号分子表达下调,说明Notch信号通路在TB发生发展中起一定作用,并且与TB患者外周血Th1/Th2失衡相关,尤其与异常升高的Th2细胞相关。2)γ-分泌酶抑制剂(DAPT)阻断TB患者Notch信号通路恢复TB患者的Th1/Th2平衡,并且抑制Th2细胞产生依赖于GATA3和IL-4表达调节,上调Notch信号通路,进一步证实Notch信号通路参与对Th2细胞调控。3)通过上调或者下调Jagged2表达,观察到Th2相关因子表达发生相应的上调或者下调,对Th1相关因子表达影响不明显,提示TB患者DCs上Jagged2表达参与Th2细胞免疫应答反应。基于以上实验结果,推测可以通过阻断Notch信号通路延缓TB进展,为结核病的免疫治疗提供了新的思路。