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菘蓝(Isatis indigotica Fort.)是十字花科(Cruciferae)菘蓝属(Isatis)二年生草本植物,属常见大宗药材,在我国各地广为栽种,具有清热解毒、凉血消斑、利咽止痛之功效。《中华人民共和国药典(2010版)》收录的板蓝根和大青叶分别为菘蓝的干燥根和叶。本研究以菘蓝为研究对象,采用响应面法(RSM),以甲醇浓度、料液比、提取温度和提取时间为考察因素,建立了靛蓝与靛玉红的最佳提取工艺与HPLC检测方法;并在此基础上分别探讨了自然生长条件下、离体培养条件下,以及不同诱导子处理条件下菘蓝中靛蓝与靛玉红的代谢积累规律。相关研究结果为深入揭示靛蓝与靛玉红的代谢积累的分子机制提供了依据,同时也为菘蓝的质量控制、合理采收、规范化生产,以及菘蓝资源的合理开发利用提供了良好的借鉴。论文获得的主要研究结果如下:(1)建立的靛蓝与靛玉红的HPLC检测条件为:流动相:A(甲醇):B(0.2%磷酸水)=75:25;柱温:25℃;流速:1.0mL/min;检测波长:289nm;进样量:10 μL。在单因素实验的基础上,用响应面法对超声提取靛蓝与靛玉红的4个技术参数进行了优化,并最终确定了菘蓝中靛蓝和靛玉红的最佳提取工艺条件为:甲醇浓度80%,料液比1:34,提取温度41 ℃,提取时间25 min。各因素对靛蓝与靛玉红的综合提取效率的影响程度由高到低依次为:甲醇浓度>料液比>提取温度>提取时间。(2)初步阐明了自然生长条件下菘蓝不同生长发育阶段、不同部位中靛蓝与靛玉红的代谢积累情况。在本研究所考察的生长发育阶段,靛蓝与靛玉红在菘蓝各部位的含量变化存在差别,但总体变化趋势较为一致;各部位靛蓝与靛玉红的含量由高到低的顺序均表现为叶>花>果>茎>根,而除了根以外,菘蓝各部位均以靛玉红的含量高于靛蓝。(3)初步研究了离体培养条件下,菘蓝中靛蓝与靛玉红的代谢积累情况。相关研究结果表明,愈伤组织中的靛蓝含量随着继代次数的增加而减少,靛玉红含量则表现为先上升后下降的变化趋势。不定芽增殖培养过程中,靛蓝与靛玉红含量的变化趋势基本一致,即随着继代次数的增加而逐步升高,并在培养至第4代达到最高值(138.88、529.54 μg/g),而后逐渐下降。总体而言,菘蓝不定芽中靛蓝与靛玉红的含量高于愈伤组织,并接近于实生苗中二者的含量。(4)考察了不同诱导子处理对菘蓝中靛蓝与靛玉红代谢积累的影响。相关研究结果表明,不同种类诱导子(MJ、SA、YE、Cu2+、Ag+)处理均对靛蓝与靛玉红的代谢积累产生一定的影响作用,并表现为不同的时间和浓度积累效应。对于靛蓝而言,各诱导子处理可在一定程度上促进其含量的升高,当MJ浓度为750μM时,靛蓝含量可升高至对照的1.70倍;对于靛玉红而言,各诱导子对靛玉红含量积累的影响存在差别,其中YE和MJ能够有效地促进靛玉红含量的升高,而SA处理早期靛玉红含量明显升高,但当处理到第4或7 d后靛玉红的含量因受到SA的作用而下降,Ag+与Cu2+处理后的第1 d,靛玉红的含量显著下降,随后又缓慢升高,并最终达到或超过对照植株的含量。