胰腺癌恶性程度较高,极易发生远处转移,患者的5年生存率不足10%。由于胰腺癌的发生和发展涉及众多基因的异常表达,因此深入挖掘胰腺癌发生和发展过程中的关键驱动基因,探讨其分子作用机制,并以此为基础寻找预防和治疗胰腺癌的新靶点,具有重要的科学研究价值和临床实践意义。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）作为一类重要的基因表达调控元件,通过与其他生物大分子相互作用,可以在表观遗传调控、转录及转录后调控、翻译以及翻译后调控等多种层面上参与调控相关基因的表达,影响肿瘤的发生和发展。研究表明,lncRNAPCAT1在多种恶性肿瘤中异常表达,且与患者预后密切相关,但PCAT1在胰腺癌中的作用机制尚待进一步研究。研究表明,RNA m~6A修饰水平的紊乱与肿瘤的发生和发展以及肿瘤患者预后不良密切相关,因此,深入研究RNA m~6A修饰在肿瘤发生和发展中的作用方式及分子机制有可能为恶性肿瘤的治疗提供新靶标。尽管研究发现了一些lncRNA自身即存在RNA m~6A修饰,并在肿瘤发生和发展进程中起着调控作用,但迄今为止,尚未见有关PCAT1与RNA m~6A修饰之间关系以及PCAT1能否通过调控RNA m~6A修饰水平影响胰腺癌恶性表型的报道。雷公藤红素是从雷公藤中提取的五环三萜,研究表明,雷公藤红素可以通过诱导细胞凋亡、抑制细胞周期进程和细胞增殖、靶向肿瘤炎症环境、抑制血管生成、抑制细胞侵袭和肿瘤转移等多种机制,在体外和体内多种癌症模型的研究中表现出潜在的抗癌活性。然而,雷公藤红素抗胰腺癌的作用机制尚未完全阐明,尤其是雷公藤红素能否通过调控RNA m~6A修饰水平发挥抑制胰腺癌恶性表型的作用尚未见报道。结合我们的前期研究基础及对相关文献资料的考证,一方面,本研究将从胰腺癌临床组织水平、胰腺癌细胞水平以及小鼠动物模型水平深入探究PCAT1通过调控RNA m~6A修饰水平促进胰腺癌生长和转移的机制。另一方面,本研究将探究雷公藤红素能否通过调控RNA m~6A修饰水平影响胰腺癌细胞增殖、细胞周期进程以及细胞凋亡,进一步揭示雷公藤红素抗胰腺癌的分子机制,为其抗胰腺癌治疗提供理论基础。本论文的具体研究内容包括以下三章:第一章LncRNAPCAT1对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响目的:探究PCAT1的表达与胰腺癌患者临床病理参数及预后的关系;研究PCAT1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭以及小鼠体内移植瘤生长和实验性转移的影响。方法:采用RNA荧光原位杂交（RNA FISH）技术检测胰腺癌组织芯片中PCAT1的表达;通过建立慢病毒介导的过表达和干扰表达PCAT1的胰腺癌细胞模型,采用CCK-8实验、EdU细胞增殖实验、细胞克隆形成实验、流式细胞术、细胞划痕以及Transwell实验检测PCAT1对胰腺癌细胞的细胞活力、细胞增殖、克隆形成、细胞周期进程、细胞凋亡、细胞迁移和侵袭的影响;通过建立裸鼠皮下移植瘤模型和实验性体内转移裸鼠模型,研究PCAT1对小鼠体内移植瘤生长和实验性体内转移的影响。结果:PCAT1表达水平与胰腺癌患者TNM分期、淋巴结转移状态密切相关（P＜0.05）;Cox多因素生存分析显示,PCAT1高表达、肿瘤直径、TNM分期、组织学分级、淋巴结转移、肝转移均是影响胰腺癌患者预后的独立性危险因素（P＜0.05）。PCAT1过表达可以促进胰腺癌细胞AsPC-1和BxPC-3的细胞增殖、克隆形成、细胞周期G1/S期进程、细胞迁移和侵袭;而PCAT1干扰表达则可以抑制AsPC-1和BxPC-3细胞的上述恶性表型。小鼠移植瘤实验结果显示,与对照组相比,过表达PCAT1组小鼠的瘤体体积和重量均显著增加,而干扰表达PCAT1组小鼠的瘤体体积及重量均显著降低;小鼠实验性体内转移模型实验结果显示,与对照组相比,PCAT1过表达组小鼠肺及肝转移灶数量明显增加,而PCAT1干扰表达组小鼠肺及肝转移灶数量明显减少。结论:PCAT1在胰腺癌组织中的高表达,并与患者总体生存期呈负相关;PCAT1可以促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭及小鼠体内移植瘤的生长和实验性体内转移。第二章LncRNAPCAT1通过m~6A-YTHDF2途径下调E-cadherin促进胰腺癌细胞迁移和侵袭的研究目的:探讨PCAT1促进胰腺癌细胞迁移及侵袭的分子机制;明确PCAT1可能通过调控RNA m~6A修饰影响上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程中关键基因E-cadherin的表达而促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。方法:本研究首先通过RNA sequencing（RNA-seq）检测过表达PCAT1的AsPC-1细胞中转录组的改变;采用RT-qPCR及Western Blot实验检测PCAT1过表达和干扰表达对胰腺癌细胞中相应的RNA m~6AWERs（Writers,Erasers和Readers）以及EMT相关基因表达的影响。其次,利用RNA dotblot、免疫荧光染色及免疫组化染色方法检测胰腺癌组织与相应癌旁组织、胰腺癌细胞系与正常胰腺导管上皮细胞中RNA m~6A修饰水平的差异;利用RNA dot blot及m~6A甲基化定量实验检测PCAT1过表达和干扰表达对胰腺癌细胞中总RNA m~6A修饰水平的影响。第三,利用建立的稳定表达带S1m标签的PCAT1的AsPC-1细胞和BxPC-3细胞进行RNA pull down实验,将获得的RNA pull down沉淀物一部分进行蛋白质谱检测,另一部分进行Western Blot实验验证;同时通过RNA免疫共沉淀结合RT-qPCR（RIP-qPCR）实验验证PCAT1是否可以与HNRNPK蛋白结合。利用Western Blot和免疫荧光染色实验分别检测PCAT1过表达和干扰表达对胰腺癌细胞的细胞核及细胞质中HNRNPK蛋白水平以及分布的影响;进一步通过在过表达PCAT1的AsPC-1和BxPC-3细胞中干扰表达HNRNPK,采用RT-qPCR及Western Blot方法检测HNRNPK干扰表达对过表达PCAT1的细胞中FTO和YTHDF2等表达的影响。第四,采用甲基化RNA免疫共沉淀结合RT-qPCR（MeRIP-qPCR）实验分别检测PCAT1对胰腺癌细胞中E-cadherin和Vimentin mRNA的m~6A修饰水平的影响;通过在过表达PCAT1的胰腺癌细胞中同时过表达FTO,采用MeRIP-qPCR以及Western Blot实验检测FTO过表达对细胞中E-cadherin mRNA的m~6A修饰水平及E-cadherin蛋白水平的影响。第五,采用RIP-qPCR实验检测YTHDF2能否与E-cadherin的mRNA结合;利用RNA稳定性实验和蛋白质稳定性实验评价PCAT1对E-cadherin的mRNA稳定性和蛋白质稳定性的影响。结果:RNA-seq检测结果显示,与对照细胞相比,PCAT1过表达组细胞中有2105个差异表达基因,其中包括部分RNA m~6A WERs成员及EMT相关的关键基因E-cadherin 和 Vimentin;RT-qPCR 及 Western Blot 验证发现,PCAT1 可下调 AsPC-1 和BxPC-3 细胞中 E-cadherin 和 FTO 表达水平,上调 Vimentin、METTL3、WTAP 及 YTHDF2的表达水平。胰腺癌组织水平的检测结果显示,与癌旁组织相比,胰腺癌组织中RNA m~6A修饰水平普遍较高,且RNA m~6A修饰水平高的患者预后不良。细胞水平的检测结果显示,与正常胰腺导管上皮细胞相比,胰腺癌细胞系中RNA m~6A修饰水平明显升高;与相应的对照组相比,过表达PCAT1的AsPC-1和BxPC-3细胞中RNA m~6A修饰水平显著升高,而干扰表达PCAT1的细胞中RNA m~6A修饰水平显著降低。RNA pull down实验结合蛋白质谱分析、Western Blot及RIP-qPCR实验结果显示,PCAT1可以与HNRNPK蛋白相互作用,但不影响细胞中HNRNPK蛋白表达水平;进一步检测发现,HNRNPK在过表达PCAT1细胞的细胞质中富集增加、细胞核中富集降低,而在干扰表达PCAT1细胞中的富集水平与之相反。同时,RT-qPCR及Western Blot检测结果显示,与过表达PCAT1的AsPC-1和BxPC-3细胞相比,HNRNPK干扰表达可进一步下调过表达PCAT1的细胞中FTO、上调YTHDF2的表达水平。MeRIP-qPCR检测结果显示,在过表达PCAT1的胰腺癌细胞中被抗m~6A抗体富集的E-cadherin的mRNA水平显著增加,而被抗m~6A抗体富集的Vimentin的mRNA无明显变化;同时,与过表达PCAT1的细胞相比,过表达FTO可以部分削弱PCAT1过表达对细胞中E-cadherin的mRNA m~6A水平及E-cadherin蛋白表达水平的影响。此外,RIP-qPCR检测结果显示,YTHDF2在过表达PCAT1的AsPC-1和BxPC-3细胞中与E-cadherin的mRNA的结合水平升高。RNA稳定性实验检测结果显示,与各自对照组细胞相比,过表达PCAT1的AsPC-1和BxPC-3细胞中E-cadherin mRNA降解速度明显加快,而干扰表达PCAT1的细胞中E-cadherin mRNA降解速度明显降低。蛋白质稳定性实验检测及统计结果显示,与各自对照组相比,过表达及干扰表达PCAT1的AsPC-1和BxPC-3细胞中E-cadherin蛋白的稳定性无明显变化。结论:PCAT1通过与HNRNPK蛋白结合抑制HNRNPK入核,一方面,通过下调胰腺癌细胞中FTO的表达而上调总RNA m~6A修饰水平,尤其是上调E-cadherin的mRNA m~6A修饰水平;另一方面,通过上调胰腺癌细胞中YTHDF2的表达而促进YTHDF2与m~6A修饰的E-cadherin mRNA的结合,诱导E-cadherin mRNA的降解而下调E-cadherin水平,促进胰腺癌细胞EMT进程,促进胰腺癌细胞的迁移及侵袭。第三章雷公藤红素通过调控RNA m~6A修饰抑制胰腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡机制的研究目的:探究雷公藤红素能否通过调控RNA m~6A修饰抑制胰腺癌细胞增殖和细胞周期进程以及诱导细胞凋亡发挥抑癌作用。方法:采用CCK-8实验、EdU细胞增殖实验、克隆形成实验以及流式细胞术研究雷公藤红素对胰腺癌细胞活力、细胞增殖、细胞周期进程以及细胞凋亡的影响。建立胰腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤成功的裸鼠随机分成溶媒对照组、雷公藤红素低剂量组（1.0 mg/kg）和雷公藤红素高剂量组（3.0 mg/kg）,研究雷公藤红素对裸鼠皮下移植瘤生长的作用。采用RNA dot blot和m~6A甲基化定量检测实验研究雷公藤红素对胰腺癌细胞中总RNA m~6A修饰水平的影响。采用RNA-seq检测雷公藤红素处理后的细胞及对照细胞中转录组的差异。利用EdU细胞增殖实验和流式细胞术检测Claspin表达对胰腺癌细胞增殖和细胞凋亡的影响,同时通过回补实验检测Claspin过表达对雷公藤红素处理后的AsPC-1和BxPC-3细胞增殖和凋亡的影响;利用RIP-qPCR实验、MeRIP-qPCR实验、RNA稳定性和蛋白质稳定性实验等方法,评价雷公藤红素调控胰腺癌细胞增殖和凋亡的具体机制。结果:雷公藤红素可呈剂量依赖性地抑制AsPC-1和BxPC-3细胞的细胞活力及细胞增殖,诱导细胞发生G2/M期阻滞,促进细胞凋亡。小鼠移植瘤实验结果显示,与对照组相比,雷公藤红素干预可以显著抑制裸鼠皮下移植瘤生长;移植瘤组织切片的Ki-67免疫组化染色及TUNEL凋亡实验结果显示,雷公藤红素干预可以显著抑制组织中细胞的增殖、促进细胞凋亡。RNA-seq检测、RT-qPCR及Western Blot检测结果显示,雷公藤红素能够显著下调胰腺癌细胞中Bcl-2、Claspin、METTL3以及YTHDF3的mRNA及其蛋白表达水平。EdU细胞增殖实验和流式细胞术检测结果发现,Claspin干扰表达可以抑制AsPC-1和BxPC-3细胞的增殖和细胞周期进程、促进细胞凋亡;而Claspin过表达则可部分逆转雷公藤红素对AsPC-1和BxPC-3细胞增殖、细胞周期进程和细胞凋亡的影响。RNA dot blot实验及m~6A甲基化定量实验检测结果显示,与对照组相比,经雷公藤红素干预后,AsPC-1和BxPC-3细胞的总RNA m~6A修饰水平显著降低。MeRIP-qPCR检测结果显示,雷公藤红素可下调AsPC-1和BxPC-3细胞中Claspin和Bcl-2的mRNA m~6A修饰水平。Western Blot检测显示,METTL3过表达可以部分逆转雷公藤红素对AsPC-1和BxPC-3细胞中Claspin和Bcl-2的抑制作用。RNA稳定性和蛋白质稳定性实验结果显示,雷公藤红素可以降低AsPC-1和BxPC-3细胞中的Claspin和Bcl-2的mRNA的稳定性,但不影响其蛋白质的稳定性。RIP-qPCR检测结果显示,经雷公藤红素干预的AsPC-1和BxPC-3细胞中被抗YTHDF3抗体富集的Claspin和Bcl-2的mRNA水平显著降低。进一步研究发现,YTHDF3过表达可以部分逆转雷公藤红素对细胞中Claspin和Bcl-2蛋白表达的抑制作用,并且YTHDF3过表达可以部分削减雷公藤红素对胰腺癌细胞增殖和细胞周期进程的抑制作用以及对细胞凋亡的诱导作用。结论:雷公藤红素通过下调胰腺癌细胞中METTL3而降低细胞中总RNA m~6A修饰水平,尤其是下调Claspin和Bcl-2的mRNA m~6A修饰水平,降低Claspin和Bcl-2的mRNA的稳定性;通过下调细胞中YTHDF3表达,减少YTHDF3与Claspin和Bcl-2的mRNA的结合而影响Claspin和Bcl-2的表达水平,抑制胰腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡。