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1、Sp1 mRNA作为Klf4的ceRNA促进成牙本质细胞分化研究目的：成牙本质细胞分化是一种非常独特且复杂的过程,有很多种分子机制参与调控成牙本质细胞分化,包括生长因子,转录因子,microRNA和信号通路等,这些分子相互联系形成网络并从不同层面上调节成牙本质细胞分化。CeRNA即竞争性内源RNA,它是一种来源于生物体内部的编码或非编码RNA,通过自身的microRNA反应元件和相关的microRNA结合,从而竞争性的对受共同的microRNA调控的其他靶基因调控,在细胞分化,器官形成和疾病发生中有着重要作用。本研究试图探索在成牙本质细胞分化过程中以转录因子Klf4为中心的ceRNA调控网络及其功能。研究方法：在本研究中,利用Targetscan数据库预测Klf4的MRE及其结合的miRNA,根据共享miRNA的数量来预测KLF4的候选ceRNA。将体外诱导小鼠牙乳头永生化细胞系(mDPC6T细胞)向成牙本质细胞样细胞分化作为模型。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测候选ceRNA中随机挑选的六个基因在nDPC6T细胞分化过程中的表达模式；同时利用mRNA原位杂交技术(ISH)检测目标基因Sp1与Klf4的mRNA在出生后第二天小鼠下颌切牙中的表达模式。利用siRNA转染的方法分别抑制Sp1与Klf4的表达,然后提取总RNA与总蛋白质,利用qRT-PCR与蛋白免疫印迹技术(western blot)检测Sp1与Klf4在mRNA及蛋白水平表达的变化。利用双荧光素酶报告实验检测Sp1与Klf4分别对于Klf4 3’UTR与Spl 3’UTR的作用。通过siRNA技术抑制Dicer酶的方法检测Sp1与Klf4之间的相互调控作用是否具有microRNA依赖性。通过western blot技术检测过表达共享microRNA对于Spl与Klf4的调控作用,并利用双荧光素酶报告实验验证了mir-la, mir-7a-5p, mir-135a-5p和mir-29b与Spl与Klf4确实存在结合。最后,在mDPC6T细胞中过表达Spl 3’UTR,利用qRT-PCR和碱性磷酸酶活性检测试验验证Sp1 3’UTR对成牙本质细胞分化的影响。研究结果：以Klf4为中心的候选ceRNA有30个,随机挑选的六个基因中,Spl, Qk和Tnrc6b的mRNA表达水平都显著上升,这与Klf4 mRNA的表达趋势一致。但是,Nfib,Nova1和Bc111a的mRNAb表达水平是显著下降的,与Klf4 mRNA的表达趋势相反；Spl和Klf4的mRNA在PN2小鼠的下颌切牙的成牙本质细胞层中具有非常相似的表达模式。抑制Spl的表达能够显著下调Klf4的表达水平,同样的,抑制Klf4的表达能显著下调Spl的表达水平。下调Spl的表达能够显著抑制含有Klf4 3’UTR区的双荧光素报告质粒的荧光素酶活性,下调Klf4的表达能够显著抑制Spl 3’UTR区荧光素酶活性。当Dicer的表达受到抑制时,Spl和Klf4的相互调控的microRNA依赖性消失；miR-la, miR-7a, miR-29b和miR-135a能同时与Spl和Klf4结合并能抑制Spl和Klf4的表达；Sp1 3’UTR能够上调DMP1,DSPP和ALP的mRNA表达水平,并能上调碱性磷酸酶的活性。结论：SP1 mRNA作为KLF4的ceRNA能够通过与Klf4竞争性的结合mir-1a, mir-7a-5p, mir-135a-5p和mir-29b米上调Klf4的表达,从而促进成牙本质细胞分化。2、转录因子SP1通过激活DMP1启动子的转录来促进成牙本质细胞分化研究目的：成牙本质细胞是一种神经嵴来源的呈现极化特征的终末分化的细胞。牙乳头细胞(DPCs)通常被认为是成牙本质细胞的祖细胞,他们具有分化为成牙本质细胞的潜能。转录因子是一类能够与基因启动子区特异性的结合,从而确保目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。已有多种转录因子被证实参与了成牙本质细胞的分化。SP1属于specificity protein/Kruppel-like转录因子(SP/KLF)家族。SP1在很多生理过程中发挥了很重要的作用,包括细胞的分化,凋亡以及胚胎的形成等。在不同的组织器官中,SP1在细胞分化过程中都具有很重要的作用。本研究试图探讨转录因子SP1在成牙本质细胞分化过程中的作用及其作用机制。研究方法：在本研究中,我们利用免疫组化的方法,检测PN2小鼠切牙中SP1蛋白的表达模式。我们利用了在体外诱导小鼠牙乳头细胞系(mDPC6T细胞),来模拟牙乳头原代细胞向成牙本质细胞分化的过程。mDPC6T细胞在矿化诱导液中连续培养0,1,5,7,11,14天,提取相应天数的蛋白,通过Western blot检测SP1蛋白的表达。同时,我们利用免疫组化检测了SP1蛋白在mDPC6T细胞向成牙本质细胞分化中的定位。为了探索SP1蛋白在小鼠成牙本质细胞分化中的功能,在mDPC6T细胞中过表达SP1的蛋白编码区(CDS)或者抑制SP1的表达,并通过qRT-PCR技术和蛋白免疫印迹技术来检测成牙本质细胞分化过程中标志性基因DMP1, DSPP和ALP的表达水平。我们还应用检测碱性磷酸酶活性和茜素红染色的方法来验证过表达或者抑制SP1表达对于碱性磷酸酶活性和矿化结节形成量的影响。利用双荧光素酶报告实验来验证SP1蛋白是否可激活DMP1启动子活性,通过在mDPC6T细胞中抑制SP1的表达的同时过表达DMP1来检测DMP1是否能挽救抑制SP1导致的成牙本质细胞分化受阻。研究结果：SP1蛋白在前期成牙本质细胞中没有表达,高表达于极化期的成牙本质细胞中；在分泌期的成牙本质细胞中SP1蛋白信号强度较弱；仅有极少数的成熟期的成牙本质细胞表达SP1蛋白。在mDPC6T细胞分化过程中,SP1蛋白水平在第7天出现显著上调,在第11天与第14天时,SP1的蛋白一直维持高表达水平。免疫荧光显示在第0天时,SP1蛋白表达在mDPC6T细胞的胞浆和胞核里,且在胞核表达较少；在诱导第7天时,SP1蛋白信号的亮度明显增强,且SP1蛋白主要集中在胞核中,在胞浆中也有微弱表达。过表达SP1可上调DMP1,DSPP和ALP mRNA和蛋白表达水平,并可促进矿化结节的形成；抑制SP1表达可下调DMP1, DSPP和ALP mRNA和蛋白表达水平,并可抑制矿化结节的形成。双荧光素酶报告实验发现SP1可以激活DMP1的启动子,并可促进DMP1的表达,并且过表达DMP1可在一定程度上挽救由于抑制SP1表达而引起的成牙本质细胞分化受阻现象。结论：转录因子SP1在小鼠牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中表达上调,并可以通过上调DMP 1启动子活性来促进成牙本质细胞分化。