D-乳酸是多种重要化学产品的合成前体广泛应用于农药、医药及材料工业,随着生物可降解材料聚乳酸的高速发展,D-乳酸的需求量不断增大。目前D-乳酸主要生产方法有化学合成法和微生物发酵法。微生物发酵法因其污染小,成本低,光学纯度高而得到广泛关注。保加利亚乳杆菌具有安全性高、酸耐受性强、产酸能力强等特点,成为工业上广泛应用的菌种之一。然而,保加利亚乳杆菌产生D-乳酸的同时,也会产生乙酸、L-乳酸等其他副产物,降低了D-乳酸的光学纯度及产量。木质纤维素是一种储量丰富的可再生生物质资源,木质纤维素生物炼制能够极大的降低成本,同时也可以解决农作物秸秆类木质纤维素废弃导致的环境污染。但,保加利亚乳杆菌自身没有木糖代谢途径,无法利用木糖。为解决上述瓶颈问题,本文以实验室保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC1.6970为出发菌种,在分析其碳代谢途径的基础上,应用同源重组技术敲除L-乳酸与乙酸代谢相关关键基因,降低副产物乙酸的产生并提高D-乳酸光学纯度及产量。以PMG36e为表达载体,在上述菌株中引入木糖利用关键酶基因（木糖异构酶基因木酮糖激酶基因）,上述两个基因整合入保加利亚乳杆菌代谢途径,赋予工程菌株利用五碳糖的能力,拓宽碳源种类,降低发酵成本。主要研究结果如下:1.通过同源重组基因敲除技术,以温敏型载体p G⁺host4构建敲除载体:成功构建L-乳酸脱氢酶基因ldb0094敲除载体p G+host4-Δldb0094;成功构建将ldb0120替换成D-乳酸脱氢酶基因（ldh A）的敲除载体p G⁺host4-Δldb0120∷ldh A;成功构建乙酸激酶基因敲除载体p G⁺host4-ΔAck。2.优化了保加利亚乳杆菌电转化方法:收集在0.1%甘氨酸的MRS培养基生长至OD_600nm=0.4-0.6的菌体,45℃温浴20 min,制备出感受态细胞;加入1-3μg待转化质粒,电转条件1000 V、800?、25μF。于0.4 mol/L蔗糖、1 mmol/L氯化镁的脱脂牛奶培养基中孵育4 h。3.将敲除载体p G⁺host4-Δldb0120∷ldh A电转入保加利亚乳杆菌,成功将L-乳酸脱氢酶基因ldb0094替换成D-乳酸脱氢酶基因（ldh A）,获得工程菌。4.从大肠杆菌中扩增木糖利用关键酶基因xyl A（木糖异构酶）与xyl B（木酮糖激酶）,成功构建木糖利用关键酶表达载体p MG36e-xyl AB。本研究成功构建乙酸激酶敲除载体、L-乳酸脱氢酶基因（ldb0094与ldb0120）敲除载体,木糖利用关键酶表达载体。上述结果为保加利亚乳杆菌碳代谢途径及工程菌的构建奠定了基础,也为秸秆生物炼制提供木糖利用的基础,具有一定的理论与实践意义。