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目的：本研究在通过细胞培养探讨雌二醇(E2)、孕酮(P)对人子宫内膜癌Ishikawa细胞体外增殖及调亡的影响，为临床子宫内膜癌术后患者可否进行HRT及如何进行HRT，提供实验室依据。
方法：
1体外培养：常规方法复苏冻存的子宫内膜高分化腺癌细胞株Ishikawa细胞接种于100ml培养瓶中，于37℃、5％二氧化碳的饱和湿度培养箱内松盖培养。以0.25％胰蛋白酶消化液消化传代。
2细胞增殖试验：取对数生长期细胞，经0.25％胰蛋白酶消化液消化后，加入培养液吹打均匀，以3×104/ml细胞浓度接种于96孔培养板，每孔加入200ul细胞悬液。培养24h后加入经无血清培养液稀释的药物至终浓度为实验浓度，E2组使17β-E2终浓度为10-9、10-8、10-7、10-6mol/l，P组P终浓度为0.5×10-5、10-5、0.5×10-4、10-4mol/l，E2+P组同时分别加入E2和P，E2终浓度分别为10-7、10-6mol/l和P终浓度分别为10-5、0.5×10-4、10-4mol/l(E2和P的终浓度根据MTT结果选取)，并设含0.01％乙醇培养液为对照。药物与细胞共培养至24h，每孔加入5mg/mlMTT20ul。继续孵育4小时后，吸去上清，加入200ul/孔DMSO终止反应，振荡10min使结晶物充分溶解，用酶标仪测490nm波长吸光度(A值)。
3细胞周期和细胞凋亡率的检测：将浓度为3×104/ml细胞悬液接种与100ml培养瓶，过夜贴壁，试验组取各组最大浓度，即E2组浓度为10-6mol/lP组浓度为10-4mol/l，E2+P组，E2和P的终浓度分别同E2组和P组。对照组加含0.01％乙醇的培养液。收集实验组药物处理24h后的细胞，冷PBS洗涤离心两次，用冷75％乙醇固定，4℃过夜，次日冷PBS洗涤离心一次，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。不同药物及不同浓度均重复3次取平均值。
4细胞形态学观察：
(1)倒置显微镜观察：每日观察细胞的生长状况及药物作用后的形态学改变。(2)光学显微镜观察：在6孔板中进行细胞爬片，药物作用24h后将片取出，PBS清洗，冷丙酮固定，姬姆萨(Giemsa)染色，光学显微镜下观察正常细胞和凋亡细胞形态。试验组取各组最大浓度，即E2组浓度为10-6mol/lP组浓度为10-4mol/l，E2+P组，E2和P的终浓度分别同E2组和P组。对照组加含0.01％乙醇的培养液。(3)电子显微镜观察：将相同浓度的Ishikawa细胞悬液接种与100ml培养瓶中，药物(浓度同上)处理后培养24小时，经0.25％胰蛋白酶消化液消化后收集细胞，4％戊二醛4℃固定、脱水、浸透、包埋、切片、染色，采用JEM-1230型透射电子显微镜观察。
5子宫内膜癌细胞株Ishikawa细胞ER、PR测定：取对数生长期的Ishikawa细胞，以1×105/ml的细胞密度接种于内置盖玻片的6孔板上，加入培养液，置于CO2培养箱中孵育24小时，再加入经无血清培养液稀释的药物，不同浓度的药物和细胞共同培养24h。试验组取各组最大浓度，即E2组浓度为10-6mol/lP组浓度为10-4mol/l，E2+P组，E2和P的终浓度分别同E2组和P组。对照组加含0.01％乙醇的培养液。药物处理24h后，取出盖玻片，自然晾干，立即以4℃冷丙酮固定10min,以链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)发测定Ishikawa细胞ER、PR。结果判定采用H-score法：每一受体2张玻片，每片至少观察5视野，阳性染色为细胞内出现棕黄色颗粒，以Ⅰ代表颜色深浅，共0～3分：0分为不着色；1分为着色浅；2分为中度着色，呈深黄色；3分为着色深，呈棕色/咖啡色。Pi代表每一着色程度的细胞所占的比例，为0-100％，H-score=∑Pi(i+1)，满分为4分。
6Ishikawa细胞Survivin蛋白表达的测定：取对数生长期的Ishikawa细胞，以1×105个/ml的细胞密度接种于内置盖玻片的6孔板上，加入培养液，置于CO2培养箱中孵育24小时，再加入经无血清培养液稀释的药物，不同浓度的药物(E2组浓度为10-6mol/l，P组浓度为10-4mol/l，E2+P组E2和P的终浓度分别同E2组和P组)和细胞共同培养24h。采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连接法(SP法)，一抗为晶美公司Survivin-Ab鼠抗人多克隆抗体,SP试剂盒为北京中山公司产品，一抗工作浓度均为1∶100。
7统计学处理
采用SPSS11.0统计软件包，计量资料以(x)±s表示，进行t检验；多组间比较采用方差分析，计数资料采用x2检验。P＜0.05为差异有显著性意义。
结果：
1E2、P和E2+P对Ishikawa细胞的增值情况的影响：E2对Ishikawa细胞生长有促进作用。随着E2浓度的增加，A值具有上升趋势，增值率逐渐升高，E2终浓度为10-8、10-7、10-6mol/l时，与对照比较及各组间比较，差异有显著性意义(P＜0.05)；而E2终浓度为10-9mol/l时，与对照比较，差异没有显著性(P＞0.05)。相反，P和E2+P两组药物均对Ishikawa细胞有明显抑制作用(P＜0.01)，且随着P浓度增加，增殖抑制率升高，增殖抑制率与P浓度之间具有显著正相关性(P＜0.05)。在E2+P组，E2和P联合作用后细胞增殖抑制率低于单独经P作用下的抑制率。
2E2、P和E2+P对Ishikawa细胞的生长周期分布和调亡率的影响：经FCM检测分析，E2组S期细胞比例上升，调亡率下降(P＜0.01)；P组和E2+P组G0/G1期细胞比例上升，S期细胞比例下降，调亡率上升，并出现细胞调亡峰(亚二倍体峰)(P＜0.01)。
3Ishikawa细胞形态学变化观察：
3.1倒置显微镜观察：E2组Ishikawa细胞的生长状态良好，细胞伸展，呈不规则多角形，随时间推移，细胞逐渐增多，细胞接触紧密。P组和E2+P组Ishikawa细胞24h时见到细胞数目减少，形态尚可，随时间推移，细胞浆内出现空泡，培养至48h时，细胞明显皱缩，体积变小，细胞渐稀增大，培养液内见少量细胞悬浮，部分细胞可见碎裂的细胞核，而胞浆仍完整。对照组细胞生长状态与E2组相似。
3.2光学显微镜观察：Ishikawa细胞经姬姆萨(Giemsa)染色后，见E2组Ishikawa细胞的生长状态良好，胞浆粉红色，胞核为紫蓝色，内有2-3个核仁，胞膜、胞核完整，可见到较多核分裂相，偶可见到染色质边集细胞。P组和E2+P组成调亡细胞形态学改变，多数细胞表现为细胞皱缩，细胞核固缩、深染，染色质边集，聚集于核膜周边或呈新月状。对照组细胞与E2组相似。
3.3电子显微镜观察细胞超微结构：E2组细胞细胞器完整，很少见到调亡细胞和调亡小体。P组和E2+P组可见较多细胞体积变小，胞浆浓缩、颜色变深，粗面内质网有不同程度的扩张；细胞核异染色质密度增高、边聚，部分细胞核的染色体高度积聚成块状在核膜下边集，有的呈月牙状，细胞核断裂，可见由膜结构包裹的小体，内含有细胞器和染色质即为调亡小体。对照组细胞与E2组相似。
4Ishikawa细胞中ER、PR的表达：Ishikawa细胞内出现棕黄色颗粒为阳性染色，其ER、PR均有表达，ER含量为(2.74±0.12)PR含量为(2.78±0.07)，两者相比差异没有显著性(p＞0.05)。经E2处理后ER、PR两者含量为(2.60±0.22)、(2.72±0.10)，经P药物处理后ER、PR两者含量为(2.65±0.11)、(2.73±0.08)，经E2+P处理后ER、PR两者含量为(2.78±0.09)、(2.75±0.12)，各组相比差异没有显著性(p＞0.05)。
5E2、P和E2+P对Ishikawa细胞Survivin蛋白表达的影响：
Survivin蛋白阳性染色位于细胞质，偶见于细胞核，以细胞胞质或胞核出现棕黄色颗粒为阳性信号。每例均随机观察5个高倍视野(×400)，用半定量积分法判断结果，阳性细胞≤5％为0分，6％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分；阳性强度黄色为1分，棕黄为2分，棕褐色为3分。两项积分相乘：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。其检测结果显示：survivin在Ishikawa细胞中均有强表达，经E2处理24小时后，Survivin蛋白表达明显升高；经P处理24小时后，survivin的表达明显下调，和对照组相比，其差异具有统计学意义，(P＜0.01)；E2+P和细胞共同孵育24小时，Survivin蛋白的表达亦下调，但下调低作用低于单用P组，两组相比，差异具有显著性，(P＜0.01)。Survivin蛋白表达在E2组最高，P组最低，三组相比，差异有显著性(P＜0.05)。
结论：E2对子宫内膜癌细胞株Ishikawa细胞有促进增值及抗调亡作用；P则抑制Ishikawa细胞增殖，并诱导其调亡；E2+P仍显示抑制细胞增殖并诱导调亡作用，与单用P组相比该作用减弱，但与P组相比有无统计学差异和E2+P具体配伍浓度有关，在E2+P组，P浓度依然是调节Ishikawa细胞生长的主要因素。调解调亡抑制蛋白Survivin的表达可能是调节纽胞调亡的机制之一。