苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在芽胞形成时会产生杀虫晶体蛋白（ICPs）,具有特异的杀虫活性。Bt对人畜安全、无毒,是目前世界上应用最为广泛的环境友好型生物杀虫剂。但在使用过程中出现蛋白质易降解、持效期短、昆虫易产生抗性等问题,因此利用分子生物学技术对Bt菌株进行遗传改良,为解决Bt制剂在生产应用上的问题提供技术途径。基于前期对Bt 4.0718全基因组测序、转录组学和蛋白质组学研究分析,筛选出可能与芽胞和晶体形成相关的重要功能基因dpaB编码吡啶二羧酸合成酶B亚基（Dipicolinic acid synthetase subunit B,dpaB）和tig编码触发因子（trigger factor,TF）。利用归巢内切核酸酶I-Sce I介导的基因缺失方法敲除dpaB基因和tig基因,对其生物学功能进行研究。dpaB基因编码的吡啶二羧酸合成酶B亚基是吡啶二羧酸DPA生物合成途径的关键酶,利用辅助质粒p RP1028构建敲除载体,采用三亲本接合转移技术将载体导入受体菌Bt 4.0718,获得dpaB基因敲除菌株Bt-ΔdpaB,同样成功构建基因回补菌株Bt-dpaB。研究基因缺失引起的菌体表型变化,结果显示:与原始菌相比,Bt-ΔdpaB稳定期延长,母细胞裂解延迟,在发酵培养基中芽胞和晶体蛋白形成受到抑制,活芽胞数减少,在GYS培养基中能产生成熟芽胞,改变GYS培养基中葡萄糖浓度,发现芽胞形成明显受到抑制。敲除菌晶体蛋白产量和对棉铃虫的杀虫毒力远低于原始菌株;回补菌表型部分恢复。选取芽胞、晶体形成相关基因进行qRT-PCR分析,结果表明敲除菌的相关基因spo类、cry类及调控基因sig类呈现不同程度下调,进一步揭示dpaB基因对芽胞和晶体蛋白形成的影响。同时在大肠杆菌中成功表达DpaB蛋白,对其进行相关功能验证。tig基因编码触发因子参与蛋白质输出,通过将新合成的蛋白质维持在开放构象中充当分子伴侣角色,具有肽基脯氨酰顺反异构酶的功能。敲除tig基因获得菌株Bt-Δtig,同时构建回补菌株Bt-tig。表型变化与原始菌相比,Bt-Δtig不产生芽胞,最大生物量减少,活芽胞数显著降低,晶体蛋白产量和杀虫毒力显著减弱,回补菌株表型部分恢复。qRT-PCR结果表明芽胞和晶体形成相关基因及调控因子均下调。同时在大肠杆菌中表达TF蛋白,为研究tig基因与晶体蛋白形成之间的关联提供新的理论基础,具有重要的科学意义和应用价值。前期通过Pull-down和Co-IP实验检测到Bt 4.0718菌株营养期杀虫蛋白Vip3A与棉铃虫中肠内65 k Da的特异性蛋白发生相互作用,经质谱鉴定为碱性磷酸酶ALP,通过构建p ET28a-vip3A、p ET28a-ALP表达载体,成功表达并分离纯化ALP和Vip3A蛋白,利用表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）进一步验证Vip3A作用于棉铃虫中肠受体ALP。