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第一部分木犀草素对离体大鼠肾内动脉肌张力的作用目的:1.观察木犀草素（luteolin,Lut）对离体大鼠肾内动脉（Intrarenal arteries,IRAs）静息张力的影响;观察Lut对血栓素类似物U46619、氯化钾KCl、苯肾上腺素（phenylephrine,PE）、血管加压素（Vasopressin,VP）和钙离子(Calcium ion,Ca2+)引起血管收缩的抑制作用以及Lut对U46619、KCl、PE、VP引起大鼠IRAs收缩的舒张作用。2.通过去钙-复钙的方法,探讨Lut对IRAs的舒张作用与细胞内外钙的关系。3.观察预孵无Cl-溶液对Lut舒张大鼠IRAs的影响。4.通过观察Ca2+激活的Cl-通道(Ca2+-activated Cl-channels,CaCCs)阻断剂CaCCinh-A01对Lut舒张大鼠IRAs的影响,探讨其作用机制。方法:1.成年雄性SD大鼠（220-250 g）腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉处死后,立即取出肾脏,分离出IRAs,用两根40μm的钢丝将其固定于微血管张力记录仪（DMT）浴槽内。在正式实验前,IRAs在浴槽中稳定1 h,每隔15 min换液一次。用60 mM KCl连续刺激三次,若连续两次IRAs收缩幅度差别小于10%,且最大收缩幅度大于2 mN,认为该血管环活性良好,稳定30 min后开始实验。2.通过PowerLab记录系统,观察不同浓度Lut（1-100μM）对大鼠IRAs静息张力的影响;在浴槽中累积加入U46619（0.01-1μM）、KCl（20-108 mM）、PE（0.1-10μM）、VP（0.1-10μM）以及在高钾PSS中加入Ca2+（0.03-10 mM）引起IRAs浓度依赖性收缩。预孵Lut（10、30、100μM）15-30 min,重新建立浓度收缩曲线。以各自的最大收缩为100%,计算Lut的最大抑制率和抑制收缩50%时所需要的药物浓度(IC50)。3.向浴槽中分别加入0.3μM U46619、60 mM KCl、1μM PE或1μM VP,当血管收缩达坪台后加入Lut,使其终浓度分别累积为1、3、10、30、100μM,建立Lut的浓度-舒张效应曲线,观察Lut对预收缩IRAs血管环张力的影响。对照组分别加入相应等体积的二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）,排除溶剂对实验的影响。以收缩剂引起IRAs收缩的最大幅度作为100%,计算最大舒张率和舒张50%时所需要的药物浓度(RC50)。4.首先预孵含乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）的无钙正常生理盐溶液（Physiological salt solution,PSS）15 min,其目的是为了使细胞外液达到一种无钙的状态,然后预孵无EGTA的无钙PSS 15 min[1],最后向无EGTA的无钙PSS中加入0.3μM U46619或60 mM KCl,当血管达到收缩坪台后加入2.5 mM CaCl2进行复钙,再次达到坪台后洗脱;预孵Lut（10、30μM）15-20 min,重复以上操作。采用去钙-复钙的方法,观察Lut对细胞外钙内流和内钙释放所致血管收缩的影响。5.向浴槽中加入0.3μM U46619或60 mM KCl,待血管收缩达坪台后,加入30μM Lut;预孵无Cl-的PSS 30 min,其中的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2分别用葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钙和硫酸镁代替;再次用0.3μM U46619或60 mM K+刺激血管,达到坪台后加入30μM Lut,观察无Cl-对Lut舒张U46619或KCl预收缩IRAs作用的影响。以最大收缩为100%,计算预孵无Cl-溶液前后Lut的舒张率。6.向浴槽中加入0.3μM U46619或60 mM KCl收缩血管,待血管收缩达坪台时,用30μM Lut舒张血管并以此作为对照。冲洗血管环并稳定30 min后再次建立血管收缩,待血管收缩达到坪台后,预孵10μM CaCCinh-A01 10 min后加入30μM Lut,观察CaCCs阻断剂对Lut舒张U46619或KCl预收缩IRAs作用的影响。以最大收缩为100%,计算加入CaCCs阻断剂前后Lut的舒张率。结果:1.Lut（1-100μM）对静息状态下的离体大鼠IRAs张力无明显影响,但预孵Lut（10、30、100μM）可以使U46619、KCl、PE、VP和Ca2+的收缩幅度减小,其最大抑制率分别为（99.94±0.00）%、（97.88±0.01）%、（100.05±0.01）%、（99.95±0.04）%和（97.82±0.02）%（P<0.05）;IC50分别为12.31、24.45、14.07、18.37和16.49μM。2.Lut（1-100μM）浓度依赖性舒张0.3μM U46619、60 mM KCl、1μM PE和1μM VP预收缩的IRAs,最大舒张率分别为（96.01±0.05）%、（90.97±0.05）%、（97.00±0.02）%、（101.58±0.04）%（P<0.05）;RC50分别为5.63、11.66、4.67、2.92μM。3.在无钙PSS中0.3μM U46619基本上不引起血管收缩,复钙之后最大收缩幅度为（2.33±0.62）m N。预孵Lut（10,30μM）能抑制复钙后离体大鼠IRAs收缩,其收缩幅度分别为（1.09±0.13）m N、（0.03±0.12）m N（P<0.05）。在无钙PSS中60 mM KCl引起的血管收缩幅度很小,复钙之后最大收缩幅度为（4.08±1.03）m N。预孵Lut（10,30μM）同样能抑制复钙后离体大鼠IRAs收缩,其收缩幅度分别为（2.52±0.51）m N、（0.67±0.48）m N（P<0.05）。4.Lut对0.3μM U46619或60 mM KCl预收缩IRAs的最大舒张比为（65.75±0.16）%或（67.22±0.14）%,而预孵无Cl-的PSS 30 min后,其舒张比分别为（42.25±0.21）%或（47.61±0.03）%（P<0.05）。5.Lut对0.3μM U46619或60 mM KCl预收缩IRAs的最大舒张比分别为（69.63±0.21）%或（56.12±0.19）%;预孵10μM Ca CCinh-A01后,其舒张比分别为（25.53±0.12）%或（43.13±0.15）%（P<0.05）。结论:1.Lut（1-100μM）对离体大鼠IRAs静息张力无明显影响;Lut（10、30、100μM）能够抑制U46619、KCl、PE、VP以及Ca2+引起的离体大鼠IRAs收缩;Lut（1-100μM）浓度依赖性舒张U46619、KCl、PE和VP预收缩的IRAs。2.Lut的舒张血管作用可能与抑制细胞外钙内流有关。3.无Cl-和Ca CCs阻断剂Ca CCinh-A01可以减弱Lut对离体IRAs的舒张作用,其舒血管作用可能与抑制Ca CCs有关。第二部分木犀草素对急性分离的大鼠肾内动脉平滑肌细胞钙激活的氯通道电流的影响目的:观察Lut对离体大鼠肾内动脉平滑肌细胞（Intrarenal arterial smooth muscles cells,IRASMCs）Ca CCs电流的影响。方法:1.大鼠肾内动脉平滑肌细胞的分离血管分离完毕后立即放入4℃、p H=7.4的细胞分离液中。首先在含有1 mg/ml牛血清白蛋白,1 mg/ml二硫丁四醇,0.5 mg/ml木瓜蛋白酶的细胞分离液（饱和O2,恒温37℃和p H=7.4）中预孵30 min;其次将血管转移至含有1 mg/ml牛血清白蛋白,0.5 mg/ml胶原蛋白酶H,0.5 mg/ml胶原蛋白酶F的细胞分离液中继续预孵5-10 min;然后加入等体积的预热的细胞分离液,继续预孵2-5 min;接着可用尖端光滑的滴管轻轻吹打;最后将分离好的细胞800 rpm,6 min离心两次,弃去上清,余1 ml放入4℃冰箱备用,8 h内用于全细胞膜片钳电生理学实验。2.采用全细胞膜片钳实验技术,观察Lut对大鼠IRASMCs Ca CCs电流的影响。待正常Ca CCs电流记录稳定后,在细胞槽中加入Ca CCs特异性阻断剂10μM Ca CCinh-A01用于验证所记录的电流是否为Ca CC inh-A01敏感的钙激活的氯电流。再次记录正常Ca CCs电流,稳定后加入30μM Lut,2 min后记录电流的变化。结果:在测试电位为+100 mV时,IRASMCs Ca CCs的稳定峰值电流为516.13±92.81p A,电流密度为39.21±8.39 p A/p F。10μM Ca CCinh-A01可抑制峰值电流密度,其抑制率为（53.65±10.69）%（P<0.05）。30μM Lut使电流密度幅度降低（55.92±0.20）%（P<0.05）。结论:30μM Lut可以抑制IRASMCs Ca CCs电流。