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目的:RNA对基因表达的影响主要包括抑制和活化基因两个方面,这些工作在数十年前就引起了生物学家的重视,近年来在RNA活化基因(RNA激活)方面的资料在不断积累。为了研究重复序列在活化基因中的作用,本研究中,使用不同组合的Alu重复序列,例如,两个Alu基因位于同一质粒或不同质粒组合,正义和反义Alu组合等,稳定或瞬时转染He La细胞,观察重复序列对EGFP报告基因表达的影响;使用生物信息学分析方法,比较人类C组染色体着丝粒与其侧翼DNA序列的RNA群结合强度,研究重复序列在RNA激活中的作用,并推理RNA激活的机理。方法:1报告质粒和诱导质粒的构建2 PSI-rTetR质粒的构建3细胞转染包括瞬时转染和稳定转染,详细方法见正文。4热休克处理5荧光显微镜观察将重组质粒转染He La细胞后,在荧光显微镜下观察EGFP荧光阳性细胞,并进行照相,计算EGFP表达量。6流式细胞仪检测7序列资料和软件从NCBI人类基因组数据库中获得序列资料,用本研究室编写的软件(Gene-Analyser2.0)分析7-nt序列。8计算RNA群结合强度的方法RNA群结合强度的算法是基于互补的RNA和DNA越多,RNA和DNA结合的可能性越大的原理来进行计算。具体的计算方法见正文。9 Tet-on系统构建Mini-C1-Alu-sense-sense(mini-Alu正正组合)等质粒,转染He La细胞用G418稳定筛选,再转染PSI-rTetR质粒,用Puro稳定筛选。得到G418和Puro双抗性的细胞。这些细胞加入Dox和不加Dox进行培养,观察EGFP表达量。10统计学处理组间的比较使用均值±SD和t检验。所有的实验重复只少三次,P<0.05认为两组有统计学差异。流式细胞仪分析图是至少3次独立实验的一个代表图。结果:1质粒表达载体的构建及鉴定本研究构建了五类表达载体:1.1基于p EGFP-C1质粒构建的表达载体,为报告质粒(Fig.1A,Table 1)。1.2基于pc DNA3.1构建的表达载体,为瞬时转染时的诱导质粒(Fig.1B,Table 1)。1.3基于PSI构建的表达载体,为稳定转染时的诱导质粒(Fig.1C,Table1)。1.4 mini-C1报告质粒(Fig.1D,Table 1)1.5 PSI-rTetR质粒,用于稳定转染实验(Fig.1E,Table 1)。2正义Alu和反义Alu组合后活化EGFP报告基因2.1正反组合的Alu重复序列对EGFP报告基因表达的影响Fig.2显示正反组合的Alu序列在稳定转染时活化EGFP报告基因,然而将这些质粒瞬时转染He La细胞时,正反组合的Alu元件没有活化EGFP基因表达的作用。当两个基因位于不同质粒,不论瞬时还是稳定转染,正反组合的Alu元件均没有明显活化基因作用(Table 4-7)。这些结果说明,Alu元件活化基因必需正反组合,必需位于同一质粒,且必需稳定转染。2.2 Alu同源序列对EGFP报告基因表达的影响将C1-Alu-sense-Alu JB-sense(Alu正Alu JB正组合),C1-Alu-senseAlu JB-antisense(Alu正Alu JB反组合)(Table 1)稳定转染He La细胞,Fig.3显示两个质粒的EGFP表达量没有明显差异,这两个质粒的EGFP基因表达量显著低于Alu正反组合的质粒,说明组合的正义Alu和反义Alu JB元件没有显著活化基因作用。3热休克对EGFP报告基因表达的影响将质粒稳定转染He La细胞后进行热休克处理,培养不同时间,观察EGFP报告基因的表达。Fig.4显示热休克使Alu正Alu JB反组合质粒的EGFP表达量显著上升,在热休克第2-4天达高峰,然后下降,在12天回到热休克前的水平。热休克对Alu正反组合质粒中的EGFP基因表达也有显著促进作用,虽不如Alu正Alu JB反质粒表现明显,但是Alu正反组合的热休克反应可以维持更长时间,到热休克第20天,EGFP的表达仍然处于较高水平。将其它的对照质粒稳定转染HeLa细胞后也进行热休克处理,热休克4天后测定EGFP的表达量,Fig.5-Fig.6的结果说明其它组合时,热休克均没有使这些质粒中的EGFP基因的表达显著提高,而且与正反组合无关。4 Tet-on系统实验进一步论证了正反组合的Alu序列活化EGFP报告基因的观点(详细实验内容见正文)。5 C组染色体着丝粒的RNA群结合强度低本研究利用生物信息学分析模拟RNA群与着丝粒序列及其侧翼序列的结合强度。关于RNA群结合强度的具体计算方法见正文。Fig.8和Table 8的结果显示着丝粒序列的RNA群的结合强度明显低于侧翼序列。结论:1质粒转染实验证明,转录的正反组合的Alu重复序列在稳定转染时能激活EGFP基因表达。热休克使Alu正反,Alu正Alu JB反质粒中的EGFP基因的表达显著上升,但是Alu正反质粒较Alu正Alu JB反质粒能维持较长时间。2生物信息学分析显示C组染色体着丝粒的RNA群结合强度显著低于其侧翼序列。着丝粒的低RNA群结合强度的结果与提出的RNA激活基因的实验结果一致。