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研究表明,丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅲ(serine peptidase inhibitor,Kazal type 3,SPINK3)不仅是一种胰蛋白酶抑制剂,而且是一类结构与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)相似的信号分子,能够与EGFR结合进而促进细胞增殖。本实验室在研究大鼠肝再生功能基因组学的基础上,发现SPINK3在大鼠再生肝中表达显著增强。同时,有文献报道其与大鼠肠上皮细胞IEC-6的细胞增殖密切相关。然而,SPINK3对肝细胞增殖、肝再生的作用和调控机制尚未有人报道。为此,本课题拟深入研究SPINK3调控大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖的分子机理。为了解SPINK3在大鼠肝再生中调控肝细胞增殖的作用及其调节机理,本文用大鼠全基因组芯片Rat Genome 230 2.0检测部分肝切除后再生肝的基因表达变化,发现SPINK3在部分肝切除(partial hepatectomy,PH)后2-24 h和72-168 h表达显著上调,其促进细胞增殖的过程基本与大鼠肝再生进程相符,本文用qRT-PCR和Western Blot验证芯片检测结果的可靠性。结合文献资料用IPA(Ingenuity Pathway Analysis 9.0,IPA)软件构建SPINK3调控肝再生的信号网络并分析其可能的作用机理,表明SPINK3可与EGFR结合,通过p38MAPK、PKC、JAK-STAT和AKT等四条信号通路调控肝细胞增殖,进一步分析表明,上述四条信号通路均对细胞增殖起到促进作用。综上所述,SPINK3在大鼠肝再生中可能通过上述信号通路促进肝细胞增殖,进而促进肝脏再生。为验证上述推测,本文用基因添加和干涉的方法处理BRL-3A细胞,对SPINK3调节BRL-3A细胞增殖的分子机理进行了初步研究。本文首先构建了SPINK3的过表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-SPINK3,包装慢病毒后侵染BRL-3A细胞,筛选出阳性单克隆,以获得能够稳定过表达SPINK3的BRL-3A细胞。同时设计并合成了两条SPINK3特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)片段,脂质体转染法转染BRL-3A细胞后,运用qRT-PCR筛选出最佳干涉片段,进而获得干涉SPINK3表达的BRL-3A细胞。MTT法分析SPINK3表达变化对BRL-3A细胞活力的影响,结果显示SPINK3过表达组细胞在24、48、72和96 h的细胞活性均比其对照组高;而转染siRNA1后,BRL-3A细胞在48和72 h细胞生长明显受到抑制。通过BrdU掺入法分析干涉SPINK3表达对BRL-3A细胞增殖的影响,发现siRNA1转染BRL-3A细胞后48 h细胞增殖明显受到抑制;利用流式细胞术检测SPINK3表达变化对BRL-3A细胞增殖和细胞凋亡的影响,发现过表达SPINK3基因对BRL-3A细胞增殖有促进作用,对BRL-3A细胞凋亡有显著抑制作用(P<0.05);而干涉SPINK3基因表达则显著抑制BRL-3A细胞增殖(P<0.05),促进BRL-3A细胞凋亡。用qRT-PCR和Western Blot等方法检测上述材料的SPINK3及其受体EGFR和相应信号通路的相关基因和蛋白的表达变化,进而分析大鼠肝再生中SPINK3调控肝细胞增殖的机理。结果表明,过表达SPINK3时,SPINK3信号通路基因ERK1、AKT1、STAT3,转录因子NF-κB1及其下游靶基因CCND1等表达上调;siRNA干涉SPINK3表达时,这些基因和蛋白表达下调。由此得出结论,SPINK3通过调节ERK1、STAT3和AKT1等基因的表达,激活ERK1/2、JAK-STAT和PI3K-AKT三条信号通路,进而调节下游细胞增殖和凋亡相关转录因子CCND1、NF-κB1、BAX、CASPASE3等的表达,最终调控体外培养的大鼠正常肝细胞BRL-3A的增殖和凋亡。