弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的成人非霍奇金淋巴瘤(NHL)类型。在所有非霍奇金淋巴瘤中它的比例约占30%,年均发病率在7-8例/每10万人次。包括环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松的标准化疗方案(CHOP)已帮助超过40%的DLBCL患者获得长期生存。此外,增加了利妥昔单抗的CHOP方案(R-CHOP)使得DLBCL患者的5年生存率提高到了接近60%。虽然随着治疗方案的进展,DLBCL患者的预后已经取得了巨大的进步,但仍有大约三分之一的患者最终死于耐药或疾病复发。分子生物学病因的不明确,限制了DLBCL治疗的进一步发展。目前,针对淋巴瘤病因的研究主要集中在两个领域——保持恶性淋巴细胞增殖发展的信号转导通路和维持淋巴瘤生存的肿瘤微环境。另外,免疫功能的紊乱在淋巴瘤的发病机制中的作用也得到了广泛的认可。作为调节免疫系统的最重要的成员——异常产生的细胞因子,经常被发现伴随某些淋巴瘤的发生。白介素-9(IL-9)作为细胞因子网络的重要组成部分,不仅直接影响淋巴瘤细胞的生长繁殖,也参与介导了肿瘤细胞和非恶性炎性浸润细胞之间的联系。20世纪80年代,IL-9最早于小鼠体内被发现,其功能主要是促进TH细胞的生长增殖。随后,人类的同源活化物也在外周血淋巴细胞与几个不同的T淋巴细胞系中被发现。IL-9与它的异源二聚体受体(IL-9R)特异性结合,该受体由α和γ两条链组成,其中,a-链是IL-9因子的特异性结合链,γ-链则是由IL-9与IL-2、IL-4、IL-7、IL-15和IL-21等细胞因子所共享的。由于对肥大细胞的多种作用功能,IL-9长期以来都被认为是过敏性炎症的一个重要的调节因子,因此针对它的生物学研究也多集中于免疫系统疾病。但近几年来,随着对其免疫靶点识别的增多,并在更广泛的细胞群体中检测到IL-9的表达,人们逐渐意识到,IL-9可能拥有比以前想象的更广泛的功能。IL-9分泌细胞的范围已经扩大到TH9、TH2、TH17、调节性T细胞(Treg)和自然杀伤性T细胞(NKT)。在动物实验模型以及人病理活检组织的一系列的研究更加证明,这种细胞因子可能会促进肿瘤的发生,尤其是淋巴瘤的发生。在霍奇金淋巴瘤(HD)及鼻型的NK/T细胞淋巴瘤患者的血清中已检测到高水平的IL-9表达。另外,组织切片的研究分析还表明,IL-9的表达与HD及间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)的发展之间存在密切的相关性。然而到目前为止,IL-9的致癌活性在B细胞淋巴瘤中仍未见报道。我们以前的研究已经证明,B淋巴细胞系的非霍奇金淋巴瘤患者,包括一些DLBCL的病例,他们的血清中IL-9水平增高。在B细胞淋巴瘤的小鼠模型中,用特定的抗体中和IL-9,可以显着地抑制肿瘤的生长。因此,我们认为,IL-9可能促进弥漫性大B细胞淋巴瘤的进展。为了检验这一假设,我们研究了IL-9及其受体在DLBCL患者的血清和病理活检组织中的表达,同时,在体外细胞株的实验研究中,IL-9也显示了对DLBCL细胞生物学行为的调控。我们的研究第一次证实了IL-9参与DLBCL的发生及发展,并与肿瘤细胞耐药性的产生有关,而特定的IL-9R基因的沉默也为DLBCL患者提供了一个潜在的治疗方法。第一部分：IL-9及其受体在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义目的：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的成人非霍奇金淋巴瘤(NHL)类型,其发病的生物学过程极其复杂,尽管有关DLBCL的治疗已经取得了极大的进步,尚不明确的分子生物学机制限制了它的进一步的发展。IL-9最初是作为TH细胞分泌的一种生长因子被发现的,它能够通过其受体(IL-9R)作用于多种免疫细胞,近年来,在某些淋巴瘤中发现有IL-9及其受体的异常表达,但是在DLBCL中未有任何关于IL-9的报道。本研究的目的是检测DLBCL患者血清中IL-9的水平和及DLBCL病理组织中IL-9R的表达,并探讨其与患者临床特征之间的相关性,为进一步研究IL-9对DLBCL细胞生物学行为的影响寻找临床依据。材料和方法：1病例标本收集2ELISA监测患者血清IL-9浓度3提取淋巴结组织RNA,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)4病理组织中的蛋白质提取与蛋白印记分析(Western-blot)5免疫组织化学染色结果：1.通过对30例DLBCL患者外周血血清样本的检测,发现DLBCL患者血清中IL-9水平升高,血清工L-9的阳性检出率为80%。DLBCL患者的血清IL-9水平与临床特点之间存在一定的相关性。IL-9表达不同的DLBCL患者在年龄、性别、血清LDH(506.3vs279.2U/L, P=0.945)和β2微球蛋白(2.35vs1.8mg/ml, P=0.202)水平上没有明显的统计学差异。但是,血清IL-9表达阳性的患者表现出较低的血清白蛋白水平(35.85±3.65vs41.8±2.12克/L,P=0.009),同时,患者的国际预后指数评分(IPI,P<0.001)也明显高于IL-9阴性患者。2.DLBCL病理组织中IL-9R表达水平升高我们分别应用逆转录PCR及Western-blot检测IL-9R在临床组织中的表达,最终确定,在DLBCL病理标本中,IL-9R在mRNA和蛋白水平均有表达。与反应性增生的淋巴结组织相比,DLBCL的肿瘤组织拥有更高的IL-9R mRNA水平。此外,通过对Western-blot蛋白条带的灰度分析表明,IL-9R蛋白在淋巴瘤组织中的表达也显著高于反应性增生的淋巴结组织。3.IL-9R表达于DLBCL细胞表面,并与患者临床特点相关通过对36例DLBCL患者的石蜡组织切片进行免疫组化染色分析发现,有22例患者(61.1%)的DLBCL组织中IL-9R蛋白表达呈阳性。IL-9R蛋白特异性表达于肿瘤细胞的细胞膜上。肿瘤组织中IL-9R蛋白的阳性表达影响患者血清β2微球蛋白(2.15±0.43比1.27±0.25,P<0.001)及白蛋白(37.36±5.28比41.73±5.3,P=0.024)的水平。此外, IPI评分,DLBCL患者中公认的最重要的临床预后指标,也与IL-9R的表达相关(P=0.005)。IL-9R表达阳性的患者具有更高的IPI评分(P=0.005),Spearman等级相关系数为0.495(P=0.004)。卡方分析结果表明,IL-9R的阳性表达与组织切片中Ki-67免疫评分有较强的相关性,Spearman等级相关分析其相关系数为0.483(P=0.009)。结论：(1) DLBCL患者血清IL-9水平升高,升高的IL-9水平与患者的血清白蛋白浓度负相关,与患者的IPI评分呈正相关。(2) DLBCL患者的病理组织中IL-9R表达水平升高。(3) DLBCL患者肿瘤组织切片中IL-9R特异性表达于细胞表面,IL-9R的阳性表达与患者的血清白蛋白浓度呈负相关,与血清β2微球蛋白水平、IPI评分及肿瘤组织中Ki-67表达指数呈正相关。第二部分：IL-9对弥漫大B细胞淋巴瘤的生物学行为的调控及其作用机制的研究目的：我们在第一部分的实验中已经证明,在DLBCL患者的血清中,存在着IL-9表达的上调,而肿瘤组织切片的免疫组化也表明,在DLBCL细胞的表面,也存在着IL-9R的表达,并且,IL-9及IL-9R的异常表达与患者的不良预后相关。在接下来的实验中,我们将在DLBCL细胞株中,检测IL-9对DLBCL细胞增殖及凋亡的影响,并且探索IL-9是否影响DLBCL细胞对R-CHOP方案中主要化疗药物的敏感性,同时检验IL-9干预DLBCL细胞后,JAK-STAT通路下游细胞凋亡基因的变化,从而对IL-9影响DLBCL细胞生物学行为的机制进行初步的探索。另外,我们还利用慢病毒载体介导的RNA干扰技术,靶向敲除IL-9R基因,检测IL-9对DLBCL细胞的调控作用的变化,达到更深入了解IL-9介导的信号通路的目的。材料和方法：1.细胞培养2.慢病毒载体介导的RNAi靶向敲除LYl及LY8细胞株的IL-9R基因3.淋巴瘤细胞株的蛋白质提取与蛋白印记分析(Western-blot)4.提取RNA,进行逆转录PCR及实时定量PCR5.流式细胞术检测细胞凋亡6. Brdu掺入法检测细胞增殖7.统计学分析结果：1.淋巴瘤细胞株中IL-9R的表达情况在5种被检测的淋巴瘤细胞株中,包括2种人DLBCL来源的细胞株LYI. LY8,三种人源的套细胞淋巴瘤(MCL)细胞株Jeko-1、Mino和SP53,以及人急性T细胞白血病细胞株Jurkat, IL-9R在mRNA和蛋白水平均有表达。2. IL-9对DLBCL细胞增殖及凋亡的影响IL-9能够剂量性的降低LYI及LY8细胞的凋亡。在LY8细胞中,80ng/mL浓度的IL-9干预剂量,能够降低细胞凋亡至基础水平的50%左右。用IL-9终浓度为80ng/mL的IMDM完全培养基培养LYI和LY8细胞72小时后,利用BrdU掺入法检测细胞增殖,结果显示,LYI和LY8细胞的增殖能够增加约20%,而LY8细胞对IL-9的反应似乎比LYI细胞更加显著。3.IL-9影响DLBCL细胞对常规化疗药物的敏感性强的松、长春新碱和利妥昔单抗均能够显著抑制DLBCL细胞的增殖,而IL-9能够降低这种抑制作用。另外,100ug/ml浓度的强的松,能够非常明显的诱导LYI及LY8细胞的凋亡,而这个过程几乎可以完全被IL-9所抑制。4.靶向敲除IL-9R基因后能IL-9对DLBCL细胞作用的变化我们利用慢病毒载体介导的RNA干扰技术靶向沉默了LYI及LY8细胞中的IL-9R基因。针对强的松诱导的细胞凋亡,IL-9作用于siIL-9R细胞的抗凋亡活性与阴性对照转染的细胞相比不太明显,IL-9对siIL-9R细胞的促进增殖的活性也有所下降。siIL-9R对IL-9的对这种对抗作用在化疗药物的存在下仍然有效。5.IL-9对DLBCL细胞内的凋亡基因的影响IL-9(80ng/ml)干预LYI和LY8细胞72小时后,检测JAK-STAT信号通路下游6种调控基因表达的变化。在LYI细胞中IL-9对p21CIP1基因的表达水平上调了2倍,而在LY8细胞中,IL-9对p21CIP1基因的mRNA水平上调超过了3倍。在LYI及LY8细胞中,IL-9对于包括MYC, BAX, BCL2L1和MCLI在内的凋亡调控基因的表达,没有明显的影响。而PIMI基因表达的变化在LYI及LY8细胞中则有所不同。在LYI细胞中,IL-9上调PIM1表达到其基础水平的2倍,而在LY8细胞中,IL-9对PIM1基因的表达几乎没有影响。结论：1.DLBCL细胞株LY1及LY8表达IL-9R的mRNA及蛋白。2.IL-9可以促进DLBCL细胞的增殖并抑制其凋亡。3.IL-9可以降低DLBCL细胞对治疗药物(CD20单抗、长春新碱、泼尼松)的敏感性。4.靶向敲除IL-9R基因能够逆转IL-9对LY1及LY8细胞的作用。5.IL-9可以上调DLBCL细胞内的p21CIP1基因水平。