亚油酸(linoleic acid,LA)属于多不饱和脂肪酸,是人体必需脂肪酸,参与生物体内许多重要的生理过程。但是亚油酸浓度过高时,也可能对细胞有毒性作用,因为其代谢可能涉及过氧化反应。产油微生物耶氏解脂酵母可以利用多种碳源合成胞内脂质。为了研究内源性亚油酸对耶氏解脂酵母细胞的毒性作用,本论文作了如下研究:通过将Δ12-脂肪酸脱氢酶基因转入耶氏解脂酵母细胞中,使其成功表达,提高细胞内亚油酸的比例。首先,通过基因工程手段将Δ12-脂肪酸脱氢酶基因连接到单拷贝表达载体p INA1312和多拷贝表达载体p INA1292上,得到重组表达质粒p INA1312-Δ12和p INA1292-Δ12。然后,将重组表达载体通过乙酸锂化学转化法转入到耶氏解脂酵母感受态细胞中基因组上,得到亚油酸含量较高的菌株,分别为1312-12和1292-12。将筛选出的重组菌株和对照菌株进行摇瓶培养,探究Δ12-脂肪酸脱氢酶基因过表达对耶氏解脂酵母生长、脂质积累、细胞形态等的影响。实验结果表明,Δ12-脂肪酸脱氢酶基因在耶氏解脂酵母中表达使生物量从8.50 g/L提高到12.75 g/L、脂肪酸中亚油酸的含量从7.01%提高到30.85%,酵母细胞的生长受到损害,并且重组菌株1292-12的细胞形态并非细胞与菌丝体共存,而是呈现体积较大的单细胞。为了证明亚油酸对酵母细胞的毒性作用,在发酵起始点在培养基中分别添加终浓度为10.00 g/L的鱼油或菜籽油来缓解毒性,在相同条件下进行发酵,测定重组菌株和对照菌株的生物量和油脂含量等,通过斑点试验测定其生长活力,观察其细胞形态。研究结果表明,添加鱼油或菜籽油作为碳源进行发酵时,重组菌株和对照菌株细胞内的C18:2比例相对降低,生物量比普通培养基发酵的重组菌株略高,但细胞形态并没有太大影响。即使在培养基中添加鱼油或菜籽油对细胞活力和脂质积累具有正面影响,但仍不足以显著逆转亚油酸对酵母细胞的毒性作用。为了进一步探究耶氏解脂酵母细胞内亚油酸的毒性作用机制,在培养基中添加终浓度为250μg/m L维生素C,测定重组菌株和对照菌株的丙二醛(Malondiadehyde,简称MDA)、活性氧(reactive oxygen species,简称ROS)、过氧化氢酶CAT和超氧化物歧化酶SOD等与脂质氧化水平相关的指标。当用维生素C处理时,相比未用维生素C处理的重组菌株,1292-12菌株细胞内的MDA含量从1.05 nmol/mg蛋白质降低到0.61 nmol/mg蛋白质;ROS含量比未用维生素C处理的低,过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性分别增加40%和87%。实验结果表明,高含量内源亚油酸对耶氏解脂酵母具有一定的毒性作用,并且与脂质过氧化过程关系密切,添加维生素C能够缓解亚油酸对酵母细胞的毒性作用,为研究多不饱和脂肪酸对细胞的毒性作用机制提供了理论基础。