戊型肝炎是由戊肝病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的一种传染性疾病,目前发病率已超过甲肝,是我国急性肝炎的主要类型。HEV基因组全长序列含有3个开放蛋白编码框(ORF1~3),其中ORF2基因编码HEV的主要结构蛋白。ORF2蛋白免疫原性强且包含中和表位集中区域。目前已有基于HEV ORF2蛋白研发的HEV抗原检测试剂盒应用于临床诊断及治疗监测中,但对于农村地区和城镇社区基层医疗单位,需要更快速、便捷的HEV抗原检测方法。本研究前期制备出多株抗HEV ORF2单克隆抗体,通过间接ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)实验对单抗进行型别分析,比较单抗间亲和力差异,筛选出与抗原结合能力强、具有广谱性的单克隆抗体;利用免疫印迹法(Western blot,WB)和竞争抑制ELISA实验对单克隆抗体识别ORF2抗原的空间位点及空间位置特征进行分析,在此基础上利用HEV疫苗免疫后兔血清和自然感染者血清分析抗体优势表位,为HEV诊断、疫苗及感染机制的研究提供了理论基础。将上述优势抗体进行组合,采用双抗体夹心法研制HEV尿液抗原检测的免疫荧光试剂,并对该快检试剂进行灵敏度和特异度评价。在制备的26株抗HEV ORF2单克隆抗体中,共筛选出8株与HEV ORF2抗原亲和力高且广谱的单抗。这些单抗重链型别为Ig G,轻链型别为Kappa,其中3株单抗的抗原表位为线性表位,另外5株单抗需进一步分析。将筛选的8株单抗和已公开报道的3株HEV ORF2中和性单抗按照抗原位点的空间位置关系分为四组,利用HEV疫苗免疫后兔血清和自然感染者血清分析抗体优势表位,发现第三组单抗(编号为8#、15#、17#、34#、58#、77#)是疫苗接种后血清和自然感染后血清中的优势抗体,其中17#单抗对自然感染后血清和抗原结合的阻断效果更加明显。将上述优势单抗进行两两组合,选择编号为15#和34#的单抗制作成免疫荧光检测试剂,该试剂能够成功检测出戊型肝炎患者尿液样本中的HEV抗原,灵敏度为76.9%,特异度为96.9%。对免疫荧光快检试剂进行优化后,灵敏度与特异度有所提高。将HEV阳性尿液样本系列稀释,免疫荧光快检试剂能检测到的终点稀释度较低于HEV抗原检测试剂盒,需进一步优化。综上所述,本研究对8株HEV ORF2单抗进行亲和力、型别及抗原表位等方面系统分析,发现了6株在戊肝疫苗接种后兔血清和自然感染HEV患者血清中占据表位优势的HEV ORF2单抗,其中1株单抗在自然感染者血清中的表位优势明显高于疫苗接种后的机体血清,提示疫苗免疫后产生的抗体可能不足以全面保护机体预防HEV病毒的感染。利用优势单抗制备出的免疫荧光快检试剂,能够检测出HEV患者尿液中的戊肝抗原,但灵敏度需进一步提高。该方法操作简单,耗时短,初步显示了其临床应用潜力。