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背景与目的多发性硬化（Multiple Sclerosis,MS）是一种发生于神经系统,病理上以炎性细胞激活为特征的免疫性疾病。小胶质细胞（microglia）是MS中被激活的一种免疫细胞,可分泌对机体有害的炎性物质,加重了损伤。EAE模型中,自噬可以减少氧化蛋白聚集,避免产生一系列反应导致病灶扩大,预后不佳。最近许多研究的表明,促进自噬可以减轻炎症并改善MS或EAE的病情严重程度。诱导自噬从而负性调控炎症级联反应,可能成为MS及EAE药物治疗的有效靶点。咖啡因（caffeine）是世界上消费最广泛的精神兴奋剂。主要存在于咖啡,茶和能量饮料等饮食来源中。咖啡因可以改善代谢和炎症反应,对自噬也有一定的诱导作用。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）是自噬的重要调控靶点。有研究报道咖啡因可以调控肝脏细胞中m TOR信号通路。本文旨在探讨caffeine对EAE炎症和自噬的具体作用,及其可能机制,为MS患者的治疗恢复,提供更多可能。第一部分:咖啡因对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠炎性细胞浸润及脱髓鞘的保护作用方法：本部分研究建立EAE小鼠模型,分别使用caffeine剂量（10/20/30mg/kg/d）从MOG35-55免疫后第0天开始干预,从临床评分,HE染色炎症细胞浸润,LFB染色脱髓鞘评分等方面对咖啡因保护EAE的作用进行评估。结果:1.CFA组:小鼠无发病,饮食正常,精神良好,体重逐渐增加。EAE+water组:MOG35-55免疫后7天左右出现症状,主要表现为食量减少,体重减轻,精神状态不佳,毛发稀疏光泽下降,活动减少,随后出现不同程度的尾部无力及肢体无力或瘫痪症状。在免疫后16天左右症状达到高峰,随后症状逐渐缓解,尾部及四肢无力症状有所减轻。EAE+caffeine（10mg/kg/d）组:MOG35-55免疫后7天左右出现症状,发病症状和病程与EAE组相似,累计症状严重程度较EAE组相比无显著变化（P>0.05）。EAE+caffeine（20mg/kg/d）组:小鼠发病较轻,体重下降较少,较EAE组评分降低（P<0.05）。EAE+caffeine（30 mg/kg/d）组:小鼠发病程度及体重下降较EAE组明显减轻,与EAE组相比评分降低（P<0.05）。2.HE染色结果显示:EAE组HE评分显著升高,炎性细胞数较CFA组明显多,脊髓内小血管周围有明显的细胞浸润和“血管-袖套样”。在EAE+caffeine（20mg/kg/d）及EAE+caffeine（30mg/kg/d）,评分与EAE组相比降低（P<0.05）,而在EAE+caffeine（10mg/kg/d）,评分所代表的炎性细胞数减轻程度不明显（P>0.05）。3.免疫后16 d小鼠脊髓LFB染色,可见EAE组髓鞘空泡多且变细,呈明显脱髓鞘特征,EAE+caffeine（10mg/kg/d）组髓鞘脱失也很严重,而随着剂量的增加,在EAE+caffeine（20mg/kg/d）组及EAE+caffeine（30mg/kg/d）组较EAE组髓鞘脱失程度减轻,LFB评分减低（P<0.05）,脊髓易被染成均匀蓝色。第二部分:咖啡因对EAE小鼠自噬水平及NLRP3炎症小体活化的作用方法:本部分分为CFA组、EAE组、EAE+caffeine（20mg/kg/d）组及EAE+caffeine+3-MA组:激光共聚焦观察各组小鼠脊髓小胶质细胞标志物Iba1的表达;WB检测各组脊髓LC3,P62,NLRP3的表达水平,ELISA检测各组小鼠脊髓组织炎性细胞因子IL-1β和IL-18表达。结果:1.Iba1平均免疫荧光强度在EAE+caffeine组比EAE组明显减低（P<0.05）;EAE+caffeine+3-MA组Iba1平均免疫荧光强度比EAE+caffeine组升高（P<0.05）。这些结果表明咖啡因可能是通过自噬途径对EAE的小胶质细胞活化起抑制作用。2.EAE+caffeine组LC3II/LC3Ⅰ水平明显高于EAE组（P<0.05）。EAE+caffeine组P62和NLRP3水平较EAE组明显降低（P<0.05）。这些结果表明咖啡因可以上调自噬水平并降低NLRP3的水平。EAE+caffeine+3-MA组LC3II/LC3Ⅰ水平低于EAE+caffeine组（P<0.05）。EAE+caffeine+3-MA组NLRP3水平高于EAE+caffeine组（P<0.05）。这些结果表明咖啡因可能通过上调自噬减少NLRP3炎症小体的激活。3.咖啡因可以降低EAE小鼠NLRP3炎性小体相关炎性因子IL-1β（P<0.05）和IL-18（P<0.05）表达,而自噬抑制剂阻断了这一保护作用,提示咖啡因的抗炎作用可能是通过自噬来调控。第三部分:咖啡因对C57BL/6小鼠原代小胶质细胞及BV2小胶质细胞系m TOR信号通路的作用方法:本部分培养原代小鼠小胶质细胞（primary microglia,PM）和BV2细胞系,WB检测咖啡因干预对自噬相关蛋白LC3、P62及m TOR通路相关蛋白p-m TOR、p-p70S6K、p-4EBP1的作用;自噬双标腺病毒检测PM自噬流;透射电镜检测小鼠PM自噬体的形成;Atg5干扰后,Western blot检测咖啡因干预PM时LC3和NLRP3的表达变化;ELISA检测IL-18和IL-1β水平。结果:1.咖啡因处理的原代小胶质细胞和BV2细胞系中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平显著升高（P<0.05）,而P62、p-m TOR/m TOR、p-p70S6K/p70S6K、p-4EBP1水平显著降低（P<0.05）。2.自噬双标腺病毒（m RFP-GFP-LC3）结果表明咖啡因干预组小鼠原代小胶质细胞中GFP/m RFP/cell明显低于对照组（P<0.05）。3.透射电镜结果表明caffeine促使PM自噬体形成。4.Caffeine+Si-Atg5组LC3-II/LC3-I水平低于Caffeine+Si-Con组（P<0.05）。Caffeine+Si-Atg5组NLRP3水平高于Caffeine+Si-Con组（P<0.05）。5.咖啡因减少炎性细胞因子IL-Iβ和IL-18释放的作用被Si-Atg5减弱（P<0.05）。结论1.咖啡因在EAE中具有抗炎性细胞浸润,减轻脱髓鞘,起到神经的保护作用,其效果呈剂量依赖性,且在疾病高峰期时效果最明显。2.咖啡因能够上调EAE小鼠脊髓的自噬水平,抑制EAE小鼠脊髓的小胶质细胞的活化和NLRP3炎症小体的活化,而用自噬抑制剂去抑制自噬后,咖啡因抑制小胶质细胞活化及炎性细胞因子释放的保护作用被减弱,说明在EAE小鼠中,咖啡因的抗炎作用与咖啡因诱导的自噬水平升高关系密切。3.咖啡因可以下调原代小胶质细胞和BV2小胶质细胞的m TOR信号通路磷酸化水平,增强原代小胶质细胞自噬流。因此,咖啡因诱导自噬抑制NLRP3炎症小体的活化的机制可能与咖啡因下调小胶质细胞的m TOR信号通路有关。