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宿主细胞通过模式识别受体识别入侵细胞的病原微生物,再通过级联放大机制诱导干扰素产生。cGAS是最主要的胞质DNA识别受体,在识别病原DNA后可催化合成cGAMP,cGAMP可激活STING,使其向核周转移,并招募TBK1和IRF3形成三元复合体,最终导致IRF3磷酸化、二聚化和入核,诱导Ⅰ型干扰素产生。然而,许多DNA病毒进化出多种策略逃逸抗病毒天然免疫反应均与该信号通路有关。我们前期实验已表明PCV2可抑制由ISD和Poly Ⅰ:C诱导的Ⅰ型干扰素产生,但是PCV2编码的蛋白哪些能在cGAS/STING信号通路中起抑制作用并不清楚,具体机制也未见报道。基于此我们筛选编码蛋白并研究其在cGAS/STING信号通路中发挥的作用,进一步揭示PCV2致病性与宿主免疫的分子机理。在本实验中,我们首先构建4个PCV2编码蛋白的表达质粒,通过双荧光素酶报告基因和qRT-PCR的结果表明PCV2编码的Rep蛋白显著抑制由cGAS-STING介导的IFN-β产生(P<0.05)。接着通过双荧光素酶报告基因和qRT-PCR实验结果表明PCV2 Rep靶向IRF3或其下游抑制IFN-β产生(P<0.05)。间接免疫荧光实验表明PCV2 Rep影响IRF3活化过程,而进一步实验表明Rep能抑制IRF3磷酸化和IRF3/5D入核,但不影响IRF3/5D二聚化,表明PCV2 Rep影响IRF3磷酸化和入核过程。免疫共沉淀实验表明Rep只与KPNA3存在相互作用,并且只阻抑KPNA3和IRF3/5D结合,此外双荧光素酶报告基因结果也证明过表达KPNA3可明显恢复Rep抑制IRF3/5D诱导的IFN-β启动子水平(P<0.05),表明PCV2 Rep通过靶向KPNA3而干扰IRF3/5D入核进而抑制IFN-β产生。在Rep表达质粒的基础上构建RepΔNLS质粒,免疫共沉淀实验显示RepΔNLS抑制KPNA3与IRF3/5D结合的能力弱于Rep,另外双荧光素酶报告基因和qRT-PCR结果也表明RepΔNLS抑制由cGAS-STING诱导的IFN-β产生的能力弱于Rep(P<0.05),表明NLS是PCV2 Rep抑制KPNA3与IRF3/5D结合以及IFN-1β产生的关键序列。通过连续将4个或6个氨基酸突变为无活性丙氨酸的方法构建6个Rep NLS突变体的表达质粒,双荧光素酶报告基因结果表明Rep NLS中22NNPS25和30KKIR33突变体抑制由cGAS-STING和IRF3/5D诱导的IFN-β产生能力最弱(P<0.05),表明其是抑制IFN-β产生的关键氨基酸位点。以上结果表明,PCV2 Rep蛋白通过与KPNA3互作而干扰KPNA3和IRF3/5D的结合进而抑制磷酸化IRF3入核最终抑制IFN-1β的产生,并且Rep NLS中22NNPS25和30KKIR33是关键的氨基酸位点。前面实验已表明PCV2 Rep通过靶向KPNA3而抑制IFN-β产生,但是KPNA3是否影响PCV2复制尚不清楚。在本实验中,通过干扰和过表达实验探究KPNA3对PCV2在PK-15细胞上复制的影响以及分子机制。干扰KPNA3并感染PCV2,培养一定时间后收集细胞检测,间接免疫荧光、绝对荧光定量PCR和Western Blotting结果显示PCV2感染细胞率、病毒拷贝数和PCV2 Cap蛋白表达水平在48和72 h时均显著升高(P<0.05);而过表达KPNA3后,PCV2感染细胞率、病毒拷贝数和PCV2 Cap蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。qRT-PCR实验结果还表明干扰KPNA3时IFN-β,ISG54,Mx1和ISG56 mRNA水平在48和72 h时均显著下降(P<0.05),而过表达KPNA3时这些基因mRNA水平均显著升高(P<0.05);抽提胞浆胞核蛋白时还发现干扰KPNA3会抑制IRF3入核,而过表达KPNA3会促进IRF3入核。同时干扰KPNA3会促进p65入核,而过表达KPNA3则相反;并且干扰KPNA3时IL-10和IL-1β mRNA水平在72 h时均显著升高(P<0.05),而过表达KPNA3时这些基因的mRNA水平均显著下降(P<0.05)。这些结果表明,干扰KPNA3会促进PCV2在PK-15细胞中复制,而过表达KPNA3则会抑制PCV2的复制,这可能是因为过表达KPNA3会促进IRF3入核并激活抗病毒反应,从而抑制PCV2复制以及NF-κB信号通路激活。综上所述,PCV2 Rep蛋白通过与KPNA3互作而干扰KPNA3和IRF3/5D的结合进而阻抑磷酸化IRF3入核并抑制由cGAS-STING诱导的IFN-β产生,并且Rep NLS中22NNPS25和30KKIR33是关键的氨基酸位点。干扰KPNA3会促进PCV2在PK-15细胞中复制,而过表达KPNA3则会抑制PCV2的复制,这可能是因为KPNA3会促进IRF3入核并激活抗病毒反应,从而抑制PCV2复制以及NF-κB信号通路激活。