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内分泌干扰物（EDCs）通过调节激素受体干扰生物体的内分泌系统，并随后影响激素的产生，储存和摄取。环境中内分泌干扰物主要来源是污水处理厂（STP）废水排放。这些废水可能含有化学品混合物，特别是家用废水，诸如天然雌激素（雌酮（E1）、雌二醇（E2）、乙炔雌二醇（EE2）、雌三醇（E3））、合成雌激素（17α-雌二醇）和具有雌激素活性的化合物（烷基酚乙氧基化物，一些农药，增塑剂，三氯生（TCS）、对辛基苯酚（POP）、双酚A（BPA）、4，4‘-（9-氟烯基）双酚芴（BHPF），这些与雌激素受体相互作用的化合物统称为环境雌激素或异种雌激素，它们在废水中的存在会对鱼类的生长、发育和繁殖产生不利的生理影响。要了解一种药物是否具有雌激素效应通常会进行药物的急、慢性毒性效应研究，这些污染物产生的雌激素效应和表观病理损伤与其作用的生物雌激素受体种类息息相关，即作用于不同受体的污染物，其造成的表观畸形、病理损伤、毒性效应和致毒机制是不同的。G蛋白偶联受体（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）作为一种新型的雌激素受体，在作用受体靶向研究中越来越受重视，而miRNA作为调控基因表达的重要生物分子对GPER调控关系的文献缺非常稀少。因此，本研究的展开对了解雌激素效应的污染物对生物体雌激素受体的影响，对EDCs的环境健康风险评估以及对污染性疾病的认识、预防、治疗具有一定意义。
研究目的：
本课题选择常见的典型EDCs，研究不同类型的EDCs亚致死剂量急性暴露对斑马鱼生长发育的毒性效应和雌激素作用受体的种类。分析斑马鱼中两类雌激素受体进行活性调控的启动子序列，进一步确证雌激素受体上游调控的重要转录因子。完成TCS暴露下miRNAs的测序，验证预测miRNA在TCS作用下的实际变化，从中筛选出mir-144作为切入点，通过显微注射其mimic和inhibitor，借助荧光定量PCR、荧光素酶分析和原位杂交技术来探讨GPER表达上调的上游机制，明确内分泌干扰污染物TCS作用的靶分子。
研究方法：
1、本文以斑马鱼（Danio rerio）脊椎模式生物作为实验材料，根据已有研究参考各类环境内分泌干扰物EC50（半致畸剂量）、LC50（半致死剂量）的测定结果，且参考环境中各类EDCs的检测浓度的相关报道，对斑马鱼进行较高浓度的暴毒处理。自胚胎持续暴露至幼鱼期（4hpf-96hpf）观察畸形情况。
2、从斑马鱼中PCR克隆合成一系列GPER与雌激素受体β（estrogen receptorβ，ERβ）（GPER片段包括-2.0kb、-1.5kb、-1kb以及-0.4kb，ERβ的片段包括-1.9kb、-1.4kb、-0.9kb以及-0.4kb）启动子片段，构建到荧光素酶报告载体中（PGL3.0），注射后用双荧光素酶分析法比较GPER与ERβ转录启动区的活性。
3、药物处理注射过荧光素酶报告载体的斑马鱼鉴别产生雌激素效应的雌激素受体种类。在上述实验的基础上，使用整体免疫荧光技术和qRT-PCR验证各类内分泌干扰物暴露对雌激素受体GPER与ERβ的影响。
4、进行TCS暴露后96h的斑马鱼全microRNA测序，从中筛选出调控靶基因GPER的miR-144作为研究对象（100≤FPKM≤110000），用qRT-PCR验证转录水平与测序结果一致后，人为干预注射miR-144的mimic和inhibitor进行miRNA过表达或敲降，验证注射后胚胎的神经系统问题。
5、根据上述实验采用WISH验证TCS暴露下miR-144抑制及过表达后GPER表达情况，确证miR-144调控靶基因。揭示TCS靶向与GPER的调控机制。
研究结果：
（1）本文选择了环境中检出率较高、报道具有内分泌干扰效应的八种典型污染物：TCS、BPA、BHPF、POP、E1、E2、EE2、E3，对斑马鱼胚胎幼鱼的生长发育和致畸作用进行综合分析，不同EDCs的毒性效应、毒力大小和畸形特征有明显差异。
（2）我们构建双荧光素酶报告系统，分析发现TCS、E2、E3处理增加了GPER的表达，BPA、POP、E2、EE2、E3处理激活了ERβ的表达，而E1、BHPF对于这两种受体均没有明显变化。
（3）构建GPER和ERβ两种受体不同区段的荧光素酶系统进行活性分析，决定调控GPER的关键活性部位在-986~-488bp启动子区域，分析此区段内能结合的转录因子分别为ARID3A、GFI1和JUND，决定调控ERβ的关键活性部位在-1998到-1491bp的启动子区域，且具有ARID3A、SOX10和FOXL1的结合位点。qPCR结果显示，在相应药物作用下，转录因子ARID3A和JUND转录水平变化趋势与GPER一致，FOXL1和ARID3A转录因子与ERβ表达趋势一致，ARID3A主要受EE2的调控。
（4）预测靶向GPER的miRNA，对不同TCS浓度暴露下（0，62.5μg/L，125μg/L，250μg/L）的斑马鱼幼鱼（96hpf）进行了microRNAs的深度测序以及生物信息学分析。
（5）选取并试验证实miR-144调控靶基因为GPER，人工干预miR-144的表达，miR-144过表达的症状会大于抑制，说明了mir-144的过表达毒性较大与TCS暴露试验产生结果一致，确定了miR-144主要调控GPER对接神经方面的通路，初步证明miR-144通过影响神经丘的发育致使神经毒性作用，进而影响幼鱼的运动活力和速度。
研究结论：
TCS、E2、E3增加了GPER的表达，BPA、POP、E2、E3、EE2激活了ERβ的表达，E2同时对这两种受体均有激活作用。而E1、BHPF作用这两种受体均没有明显变化。TCS作用于JUND促进GPER表达增加；POP通过FOXL1转录因子促进ERβ表达增加。E2作用于ARID3A同时调控GPER和ERβ转录。本文证明不同环境雌激素致毒效应和诱发表观畸形的不同，主要是源于其主要作用靶分子和雌激素受体不同所致。筛选出以GPER为调控靶基因的miR-144为对象，揭示TCS靶向miR-144对GPER转录后调控异常诱发神经毒性效应的机制。上述研究明确了环境中常见的典型EDCs致毒的作用靶分子及致毒的上游调控机制，为新型miRNA药物治疗污染性疾病提供了基础导向。
研究目的：
本课题选择常见的典型EDCs，研究不同类型的EDCs亚致死剂量急性暴露对斑马鱼生长发育的毒性效应和雌激素作用受体的种类。分析斑马鱼中两类雌激素受体进行活性调控的启动子序列，进一步确证雌激素受体上游调控的重要转录因子。完成TCS暴露下miRNAs的测序，验证预测miRNA在TCS作用下的实际变化，从中筛选出mir-144作为切入点，通过显微注射其mimic和inhibitor，借助荧光定量PCR、荧光素酶分析和原位杂交技术来探讨GPER表达上调的上游机制，明确内分泌干扰污染物TCS作用的靶分子。
研究方法：
1、本文以斑马鱼（Danio rerio）脊椎模式生物作为实验材料，根据已有研究参考各类环境内分泌干扰物EC50（半致畸剂量）、LC50（半致死剂量）的测定结果，且参考环境中各类EDCs的检测浓度的相关报道，对斑马鱼进行较高浓度的暴毒处理。自胚胎持续暴露至幼鱼期（4hpf-96hpf）观察畸形情况。
2、从斑马鱼中PCR克隆合成一系列GPER与雌激素受体β（estrogen receptorβ，ERβ）（GPER片段包括-2.0kb、-1.5kb、-1kb以及-0.4kb，ERβ的片段包括-1.9kb、-1.4kb、-0.9kb以及-0.4kb）启动子片段，构建到荧光素酶报告载体中（PGL3.0），注射后用双荧光素酶分析法比较GPER与ERβ转录启动区的活性。
3、药物处理注射过荧光素酶报告载体的斑马鱼鉴别产生雌激素效应的雌激素受体种类。在上述实验的基础上，使用整体免疫荧光技术和qRT-PCR验证各类内分泌干扰物暴露对雌激素受体GPER与ERβ的影响。
4、进行TCS暴露后96h的斑马鱼全microRNA测序，从中筛选出调控靶基因GPER的miR-144作为研究对象（100≤FPKM≤110000），用qRT-PCR验证转录水平与测序结果一致后，人为干预注射miR-144的mimic和inhibitor进行miRNA过表达或敲降，验证注射后胚胎的神经系统问题。
5、根据上述实验采用WISH验证TCS暴露下miR-144抑制及过表达后GPER表达情况，确证miR-144调控靶基因。揭示TCS靶向与GPER的调控机制。
研究结果：
（1）本文选择了环境中检出率较高、报道具有内分泌干扰效应的八种典型污染物：TCS、BPA、BHPF、POP、E1、E2、EE2、E3，对斑马鱼胚胎幼鱼的生长发育和致畸作用进行综合分析，不同EDCs的毒性效应、毒力大小和畸形特征有明显差异。
（2）我们构建双荧光素酶报告系统，分析发现TCS、E2、E3处理增加了GPER的表达，BPA、POP、E2、EE2、E3处理激活了ERβ的表达，而E1、BHPF对于这两种受体均没有明显变化。
（3）构建GPER和ERβ两种受体不同区段的荧光素酶系统进行活性分析，决定调控GPER的关键活性部位在-986~-488bp启动子区域，分析此区段内能结合的转录因子分别为ARID3A、GFI1和JUND，决定调控ERβ的关键活性部位在-1998到-1491bp的启动子区域，且具有ARID3A、SOX10和FOXL1的结合位点。qPCR结果显示，在相应药物作用下，转录因子ARID3A和JUND转录水平变化趋势与GPER一致，FOXL1和ARID3A转录因子与ERβ表达趋势一致，ARID3A主要受EE2的调控。
（4）预测靶向GPER的miRNA，对不同TCS浓度暴露下（0，62.5μg/L，125μg/L，250μg/L）的斑马鱼幼鱼（96hpf）进行了microRNAs的深度测序以及生物信息学分析。
（5）选取并试验证实miR-144调控靶基因为GPER，人工干预miR-144的表达，miR-144过表达的症状会大于抑制，说明了mir-144的过表达毒性较大与TCS暴露试验产生结果一致，确定了miR-144主要调控GPER对接神经方面的通路，初步证明miR-144通过影响神经丘的发育致使神经毒性作用，进而影响幼鱼的运动活力和速度。
研究结论：
TCS、E2、E3增加了GPER的表达，BPA、POP、E2、E3、EE2激活了ERβ的表达，E2同时对这两种受体均有激活作用。而E1、BHPF作用这两种受体均没有明显变化。TCS作用于JUND促进GPER表达增加；POP通过FOXL1转录因子促进ERβ表达增加。E2作用于ARID3A同时调控GPER和ERβ转录。本文证明不同环境雌激素致毒效应和诱发表观畸形的不同，主要是源于其主要作用靶分子和雌激素受体不同所致。筛选出以GPER为调控靶基因的miR-144为对象，揭示TCS靶向miR-144对GPER转录后调控异常诱发神经毒性效应的机制。上述研究明确了环境中常见的典型EDCs致毒的作用靶分子及致毒的上游调控机制，为新型miRNA药物治疗污染性疾病提供了基础导向。