研究目的：孤独症谱系障碍（ASD）是一种终生的神经发育障碍疾病，主要表现为早发性的社交、运动和认知障碍等，严重影响生活质量。根据诊断标准，2012年的统计报道全球ASD的患病率已达到1%-2.6%，且呈现出逐年增长的趋势。染色质域解旋酶DNA结合蛋白8（Chd8）是SNF2家族ATP依赖的染色质重塑蛋白，位于14q11.2区域，并与β-catenin结合发挥其在染色质重构中的功能。在对ASD相关基因进行外显子测序等分析发现，chd8基因与ASD具有高相关性，被确认为ASD发病的重要原因之一，chd8异常导致的ASD患者的表型特征为头部增大、前额突出、尖下巴等。目前关于自闭症的致病机理尚未明确，而ASD高风险基因chd8的致病机理仍然有待深入探究。除了遗传因素外，环境因素（如药物、环境污染物等）的作用也不容小觑，虽然已有啮齿类动物自闭症模型建立，但实验周期长，成本高，很难实现对增加自闭症风险的环境污染物等的高通量筛查。而斑马鱼个体小、繁殖能力强、生长速度快等优势，以及斑马鱼大脑在神经结构和功能上与人类大脑病理特征具有相似性，因此建立经济有效的chd8突变自闭症动物模型将对其研究产生推动作用，为探究自闭症致病机制、临床药物的开发以及环境污染物对自闭症的风险评价提供了便捷。
　　研究方法：本研究从三个部分探讨：第一部分为chd8突变斑马鱼自闭症模型的构建。通过在线基因靶点预测网站选择设计chd8基因靶点，然后目标序列片段的体外合成；采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过显微注射方法将目标基因gRNA导入斑马鱼胚胎中，结合高通量熔解曲线法（HRM）和DNA测序对斑马鱼注射胚胎进行3代突变体筛选，最终筛选出chd8纯合突变斑马鱼。第二部分是对构建成功的chd8突变斑马鱼进行发育、神经行为学以及凋亡相关因子的表达进行评价；发育指标主要对突变体斑马鱼的胚胎孵化率、畸形率、死亡率以及体长、头部大小进行统计；在行为学方面以强致自闭症化合物VPA作为阳性对照，对突变体斑马鱼运动行为和社会行为进行检测。最后AO染色对突变体斑马鱼头部和尾部细胞凋亡的影响以及凋亡相关基因和蛋白表达的检测。第三部分是将chd8突变斑马鱼暴露于新型持久性有机污染物BPA，探究环境污染物协同自闭症高风险基因对自闭症发生风险的环境毒理学评价。
　　研究结果：通过DNA测序等技术手段，在筛选至F1代斑马鱼时发现chd8-gRNA1注射组突变效率较低，最终保留chd8-gRNA2注射组斑马鱼后代，经过3代筛选后成功建立缺失4个碱基的纯合体斑马鱼。对突变斑马鱼的发育情况进行分析，发现chd8突变对斑马鱼胚胎的孵化（48hpf、60hpf、72hpf）、畸形和死亡（5dpf）无明显影响；通过测量发育至5dpf斑马鱼的体长、眼间距以及头部软骨发育指标（ID、CCL和LJL），结果显示chd8突变对斑马鱼的体长无影响，但斑马鱼头部软骨发育指标比对照组减小，表明chd8突变导致斑马鱼头部变小。而神经行为学检测结果发现，chd8突变降低了斑马鱼（5dpf）在闪光刺激时的反应能力；增加了斑马鱼（5dpf）的运动活力；在10dpf黑白区域探索实验中，突变斑马鱼比对照组斑马鱼更喜欢待在黑暗区域；11dpf的鱼群聚集实验结果显示，chd8突变导致斑马鱼鱼群聚集能力降低；在12dpf的镜面实验中，突变体斑马鱼对镜面内的影像接触次数减少，显示出冷漠态度。对突变体斑马鱼细胞凋亡检测结果显示，chd8突变导致24hpf斑马鱼头部区域细胞凋亡显著增多，在转录水平上，增加了凋亡相关基因Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associated X,bax）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase3,caspase3）mRNA的表达。BPA暴露chd8表达缺陷突变体斑马鱼组与未暴露突变体组相比，减少了黑白区域探索实验中在白光区域的滞留时间；增加了集群实验中NND和IID；减少了镜面反应实验中与镜面的接触次数和待在镜面区域的时间。
　　研究结论：本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，靶向敲除chd8基因，成功构建了chd8表达缺陷突变体斑马鱼；构建的chd8表达缺陷突变体斑马鱼头部发育异常，运动行为学显示chd8突变降低了斑马鱼对外界刺激的反应能力；社会行为学显示chd8突变体斑马鱼出现焦虑、反应能力迟缓、社交互动减少，这些行为特征验证了该突变体作为自闭症动物模型的行为学基础。BPA协同chd8缺陷增加了斑马鱼自闭症发生风险，表明chd8突变斑马鱼模型在毒理学中的适用性。