背景:新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是新生儿期一种常见的严重消化道疾病,尤其好发于早产儿与低出生体重儿。由于NEC的发病机制尚未完全阐明,早期诊断十分困难,缺乏有效的治疗手段,导致目前临床上NEC患儿的预后差、病死率高。临床研究已发现:早产、人工喂养、肠道缺氧缺血性损伤、肠道菌群异常定植等是NEC发生的主要危险因素;强烈的炎症反应与肠道粘膜上皮屏障损伤是NEC发病过程中的重要环节。如何对NEC发病过程中的炎症反应水平进行合理调控,并保护其肠道粘膜上皮屏障,将成为改善NEC预后的关键。研究发现趋化因子CXCL5及其受体CXCR2与机体的炎症性疾病(如:炎症性肠病)调控有关。NEC作为一种新生儿肠道炎症性疾病,CXCL5及其受体CXCR2如何参与其发病过程并发挥作用仍不清晰。因此,本课题拟对CXCL5、CXCR2在NEC发病过程中的作用进行继续探讨,以期为临床上NEC的预防、诊断、治疗提供具有潜在应用价值新靶点。第一部分CXCL5及其受体CXCR2在NEC中的表达变化及临床意义目的:探讨趋化因子CXCL5及其受体CXCR2的表达变化与NEC发病的临床相关性及意义。方法:收集对照及NEC患儿的血液样本并分离血浆,利用流式微球技术(CBA)及酶联免疫分析技术(ELISA)进行炎症因子及CXCL5水平检测。收集NEC患儿手术中切除的肠道组织,荧光实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测CXCL5及其受体CXCR2的mRNA表达情况。结果:对纳入研究的对照组(n=14)及NEC组(n=13)患儿的一般情况进行比较,结果显示:组间差异无统计学意义,两组患儿的基线资料具有可比性。利用CBA检测血浆炎症因子水平,结果显示:与对照患儿相比,NEC患儿血浆中IL-6、IL-8、IL-10的水平均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),而血浆中IL-1β、TNF-α的表达水平在两组间未显示出统计学差异。通过ELISA检测血浆中CXCL5表达,结果显示:与对照组相比,NEC组患儿血浆中CXCL5表达水平明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR检测肠道组织样本中CXCL5、CXCR2的mRNA表达,结果显示:与对照组相比,NEC肠道组织中CXCL5mRNA表达有增高趋势,但差异未达到统计学意义,而NEC肠道组织中CXCR2 mRNA的表达水平较对照组明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果提示NEC肠道组织中CXCR2的蛋白表达水平较对照组明显上调,差异同样具有统计学意义(P<0.05)。结论:NEC患儿处于炎症高反应状态,血浆中炎症因子的释放水平明显增高;伴随NEC的发生,患儿体内CXCL5、CXCR2的表达出现上调。CXCL5及其受体CXCR2表达变化与NEC发病具有临床相关性,可能参与NEC的发病调控,但其具体作用仍有待于进一步研究。第二部分调控CXCR2对实验性NEC动物模型的保护作用研究目的:探讨利用基因敲除技术调控CXCR2的表达对实验性NEC动物模型的保护作用。方法:将50只出生日龄5d的Cxcr2基因敲除小鼠及SPF级C57BL/6野生型小鼠随机分为:野生对照组(C-wt组)、敲除对照组(C-ko组)、野生NEC组(N-wt组)、敲除NEC组(N-ko组)。其中,纳入对照组的小鼠继续由母鼠进行母乳喂养,并无其他干预因素;而NEC组的小鼠通过“人工喂养+缺氧+LPS”联合刺激的方法诱导实验性NEC的发生。诱导96 h后建模结束,对幸存小鼠进行麻醉,收集血液及末端回肠样本用于后续分析。结果:各组小鼠一般情况进行比较,结果显示:C-wt与C-ko组小鼠在建模期间一般状态佳,体重较建模前增长,未出现小鼠死亡情况;而N-wt与N-ko组小鼠状态较造模前差,体重较前减轻,均有小鼠死亡发生,其中N-ko组小鼠体重丢失程度低于N-wt组,生存率高于N-wt组,差异具有统计学意义(P<0.05)。进一步,对小鼠血浆及肠道样本进行检测分析,结果表明:Cxcr2基因敲除后血浆中CXCL5释放减少,肠道组织中CXCR2受体表达降低,可减轻NEC肠道粘膜病理损伤,改善肠道粘膜通透性,增加肠屏障蛋白表达,抑制血浆中炎症因子IL-6,TNF-α,MCP-1的释放。此外,Western Blot结果显示肠道组织中p-AKT表达在N-wt组明显增加,与之相比,N-ko组的表达则被下调。结论:通过Cxcr2基因敲除明显下调实验性NEC小鼠肠道组织中CXCR2受体的表达,并抑制NEC小鼠血浆CXCL5的释放,对实验性NEC小鼠具有一定的保护作用。AKT可能是与这种保护作用相关的下游关键信号分子,该保护作用涉及的具体机制仍需进一步研究。第三部分FTY720靶向调控CXCL5/CXCR2轴对实验性NEC动物模型的保护作用目的:探讨FTY720靶向调控CXCL5/CXCR2轴对实验性NEC动物模型的保护作用。方法:将50只出生日龄5 d的SPF级C57BL/6小鼠随机分为:正常对照组(Ctrl组)、NEC建模组(NEC组)、FTY720干预组(FTY720组)。其中,纳入Ctrl组的小鼠继续由母鼠进行母乳喂养,并无其他干预因素;而NEC组的小鼠通过“人工喂养+缺氧+LPS”联合刺激的方法诱导实验性NEC的发生;FTY720组小鼠除给予与NEC组小鼠相同的处理因素外,并每日给予FTY720(1μg/g小鼠体重)作为干预措施。NEC诱导96 h后建模结束,对所有幸存小鼠实施麻醉,并采集血液及末端回肠样本用于后续分析。结果:NEC建模结束后,各组小鼠一般情况进行比较,结果显示:对照组小鼠的体重较前增加,而NEC组与FTY720组小鼠的体重均较前减轻,其中FTY720组小鼠的体重丢失程度低于NEC组,差异具有统计学意义(P<0.05);FTY720干预后小鼠的生存情况较NEC组有显著改善,差异具有统计学意义(P<0.05)。各组小鼠的血浆及肠道样本检测分析,结果显示:与NEC组相比,FTY720干预可减轻实验性NEC小鼠的肠道粘膜损伤,减少肠道粘膜上皮细胞凋亡,增加肠道屏障蛋白的表达,降低血浆中炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1和CXCL5的释放水平,并下调肠道组织中炎症相关的基因(IL-6和F4/80)的mRNA表达水平,FTY720干预显著下调了肠道组织中CXCL5/CXCR2轴的表达水平。结论:FTY720干预能有效降低实验性NEC小鼠的体重丢失程度,提高造模期间生存率,减轻肠道损伤程度,减少肠道粘膜上皮细胞凋亡,增加屏障蛋白表达,抑制全身及局部炎症反应水平,对实验性NEC小鼠具有一定的保护作用。FTY720对实验性NEC的保护作用可能与其靶向下调肠道组织中CXCL5/CXCR2轴的表达相关。