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作为目前所知的机体内功能最强的专职抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC),树突状细胞(Dendritic cell, DC)在识别抗原、启动免疫应答或是诱导免疫耐受的过程中发挥着重要的作用。DC作为一种异质性的细胞群体,因存在的解剖部位和功能状态不同,分为许多种亚群。这些亚群在不同的成熟阶段可以呈现不同的表型,表达多种细胞因子,其功能也具有多样性。以往人们对DC的认识仅局限于其激活免疫方面的功能,但近年来的大量研究证明了DC也具有负向调节免疫的功能并将这类DC称为调节性DC(Regulatory DC).本实验室在以往的研究中发现,曾被认为是终末分化细胞的成熟DC,在与脾脏基质细胞共培养后,可以进一步增殖,并且分化为一类新型的调节性树突状细胞,将其命名为“分化样树突状细胞”(Differentiated dendritic cells, diffDC)。该群DC可以通过分泌NO来抑制CD4+ T细胞的增殖,但不会显著诱导调节性T细胞的产生。diffDC的发现,打破了以往人们对“终末分化细胞”的定义标准：成熟DC在完成抗原提呈任务后在次级淋巴器官微环境作用下可以进一步增殖分化并被赋予新的生命与功能。T细胞是免疫系统中重要的效应性细胞。初始T细胞在树突状细胞及其他抗原提呈细胞的作用下识别相关抗原,并发生级联性扩增,激发抗原特异性的细胞免疫及体液免疫,从而在抗御病原体感染中发挥重要作用。其中,CD8+ T细胞是机体细胞免疫的主要效应细胞。CD8+细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)是具有免疫杀伤效应的细胞亚群,可以特异性识别抗原,在MHCI类分子限制的条件下直接、连续与特异性地杀伤靶细胞。但是在免疫应答中,效应性CD8+ T细胞无限制的扩增必定会引发如自身免疫疾病等不良后果,因此,针对CD8+ T细胞的免疫负向调控方面的研究就显得尤为重要。DC在CD8+ T细胞的增殖与活化中如何发挥调控作用,其具体机制又是什么,目前尚不完全清楚。我们围绕着本实验室以往发现的调节性DC(diffDC)对CD8+ T细胞的调控作用及其机制进行了研究。首先,我们研究了diffDC对OVA特异性CD8+T细胞的增殖、活化的影响,结果发现diffDC能够抑制CD8+ T细胞的增殖与活化。之后,我们进一步对diffDC对CD8+ T细胞产生抑制作用的机制作了初步的探讨。一.调节性树突状细胞抑制CD8+ T细胞的增殖与活化在本部分实验中,我们研究了调节性树突状细胞对CD8+ T细胞功能的调控作用。OT-I转基因小鼠来源的CD8+ T细胞能特异性识别OVA257-264多肽,是体外验证单一抗原肽特异性抗原提呈反应的良好反应细胞。我们采用OT-I小鼠来源的CD8+ T细胞作为反应细胞,C57BL/6(H-2Kb)小鼠来源的荷载OVA257-264多肽的DC作为刺激细胞。为检测diffDC在该体系中的功能,我们将不同比例的diffDC加入到共培养体系(maDC/CD8)中,结果显示,diffDC显著抑制了由成熟DC(mature DC, maDC)诱导的CD8+ T细胞的增殖,并且此种抑制作用呈diffDC细胞数量依赖性。采用CFSE标记的CD8+ T细胞也得到同样的实验结果。分析细胞周期状况也发现类似的实验结果：在共培养体系内加入diffDC后,CD8+ T细胞中处于细胞周期活跃期的细胞比例减少。这些结果表明diffDC抑制了CD8+ T细胞的分裂增殖。在对上述共培养体系中的CD8+ T细胞的活化表型及培养上清中存在的细胞因子进行分析时,我们发现diffDC抑制了CD8+ T细胞活化表型CD25的上调,并且下调了CD8+ T细胞CD62L的表达水平。CD8+ T分泌的细胞因子IL-2也有所降低。我们还利用实时定量PCR检测了共培养后的CD8+ T细胞内颗粒酶B和穿孔素的表达水平,结果发现共培养体系中加入diffDC后,CD8+ T细胞表达的颗粒酶B和穿孔素显著降低。这些结果表明diffDC抑制了CD8+ T细胞的活化。调节性T细胞最显著的功能特点在于抑制其他T细胞在接受抗原刺激时的增殖。那么,diffDC是否可以通过诱导调节性T细胞产生从而抑制CD8+ T的增殖活化呢?我们检测了diffDC诱导CD122+ CD8+调节性T细胞产生的能力,结果发现,diffDC并不能诱导CD122+CD8+调节性T细胞产生。以上结果提示,diffDC对特异性CD8+T细胞的增殖与活化可以起到抑制作用。此抑制作用很可能使CD8+T细胞保持一种相对耐受的免疫状态,从而维持免疫系统的平衡与稳定。二.调节性树突状细胞抑制CD8+T细胞增殖与活化的机制研究在本部分,我们对于diffDC如何抑制了CD8+T细胞的增殖与活化的机制进行了研究。调节性T细胞最显著的功能特点在于抑制其他T细胞在接受抗原刺激时的增殖。那么,diffDC是否可以通过诱导调节性T细胞产生从而间接地抑制了CD8+T的增殖与活化呢?我们检测了diffDC诱导CD122+ CD8+调节性T细胞产生的能力,结果发现,diffDC并不能诱导CD122+ CD8+调节性T细胞产生。CD8+ T细胞的增殖受到抑制,可能是因为diffDC促进了T细胞的凋亡。我们对此做了检测。结果发现,在有diffDC存在的情况下,CD8+ T中7-AAD+的凋亡细胞的比例并没有明显增加。T细胞失能后,会失去对抗原的反应性。调节性DC发挥作用的机制之一是诱导T细胞失能或是低反应性。因此,我们对diffDC是否拥有这样的作用进行了研究。我们先将特异性CD8+ T与荷载了OVA257-264的maDC或是diffDC共培养,2天后用磁珠阳选获得CD8+ T细胞,在IL-2存在的条件下静息2天后用DC进行再刺激,结果发现,经diffDC诱导后的CD8+ T再次刺激后增殖的能力并未受到影响,细胞内颗粒酶B的RNA水平也没有显著的降低。说明diffDC不能诱导CD8+ T细胞的失能。为了确定diffDC究竟是通过产生的可溶性分子或是膜分子,抑或是diffDC的膜分子与maDC或活化的CD8+ T细胞上的膜分子作用后产生的可溶性因子作用于CD8+ T细胞从而抑制其特异性增殖与活化,我们采用Transwell系统将diffDC与maDC/CD8T隔开,然后进行培养和观察,结果发现diffDC与maDC／CD8T细胞隔开后,其抑制OVA特异性CD8+ T细胞的活化的能力降低,但是抑制CD8+ T增殖的能力没有完全丧失,表明diffDC抑制CD8+ T细胞活化的作用是需要细胞与细胞间的接触来介导的,即：直接由diffDC上的膜分子,或间接由diffDC上的膜分子与maDC或活化型CD8+ T细胞作用后产生的可溶性因子来介导；而其抑制CD8+ T细胞增殖的作用则需要可溶性分子和膜分子双方面的作用。diffDC的一个重要表面标志是高表达CD11b。我们在diffDC抑制CD8+ T增殖的共刺激体系中加入CD11b的阻断性抗体后,没能有效逆转diffDC对抗原特异性CD8+T的增殖的抑制作用,说明CD11b可能并不直接参与diffDC对抗原特异性CD8+ T的抑制效应。我们在实验中发现,与diffDC共培养过的CD8+ T细胞表面表达的FasL与对照组没有区别,但Fas的表达增加,联想到diffDC组成性高表达FasL的特性,猜想这可能是造成diffDC对抗原特异性CD8+ T的增殖抑制的原因。但是在实验中我们发现,在反应体系中加入FasL阻断性抗体,不能逆转diffDC对抗原特异性CD8+ T的增殖抑制作用。diffDC高表达FasL的意义或许更多的是在其他方面发挥重要功能。有研究报道,NO可以阻断IL-2下游的信号通路,从而抑制T细胞增殖,我们由此得到启发检测了各个共培养体系中NO的含量,结果发现,diffDC/maDC/CD8T共培养体系中有高量的NO分泌,而对照组中的NO则远远低于该组,提示NO可能是抑制T细胞增殖的效应分子。我们用L-精氨酸的类似物L-NAME阻断NO的合成,结果显示CD8+ T细胞的增殖抑制被极大程度地逆转。在Transwell小室中,diffDC和maDC/CD8T分隔开后,体系中的NO浓度大大降低。以上结果说明,diffDC和maDC/CD8T的细胞膜接触产生的NO介导了diffDC对maDC诱导的CD8+ T细胞特异性增殖的抑制作用。以上结果表明,diffDC对CD8+ T细胞活化的抑制作用依赖于diffDC与成熟DC和CD8+ T间的直接接触,而对CD8+ T细胞增殖的负向调控则是细胞直接接触和可溶性分子双方面的作用。diffDC可以通过诱导NO的生成来对CD8+ T细胞的增殖反应起负向调控作用综上所述,diffDC可以通过细胞间接触产生的NO来抑制特异性CD8+ T细胞的增殖和活化,发挥负向免疫调控功能。本研究结果将有助于更好地理解调节性DC参与免疫调控的机制,为研究机体自身耐受,探索肿瘤和自身免疫疾病等临床疾病的发病机制和免疫治疗的设计及应用提供了新的研究途径及理论基础。