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目的利用肝脏基质细胞(liver stromal cells, LSCs)诱导成熟树突状细胞(mature dendritic cells,mDCs)分化形成调节性树突状细胞(regulatory dendritic cells,DCreg),探讨DCreg对抗原特异性CD8+T细胞的免疫负向调节作用。方法1.免疫磁珠分选技术分选C57BL/6小鼠骨髓来源的mDCs, LSCs诱导后的DCreg, MHC I类分子限制的OVA257-264抗原肽特异性TCR转基因OT1小鼠的CD8+T细胞。2.流式细胞仪检测DCreg, mDCs,不成熟树突状细胞(immature dendritic cells, imDC)细胞膜表面分子表达,抗原特异性CD8+T细胞活化、增殖和细胞因子的分泌。3. CFSE标记技术检测抗原特异性CD8+T细胞分裂。4. RT-PCR技术检测肝脏基质细胞表达的细胞因子及趋化因子。5.采用过继回输DCreg, mDCs及CD8+T的方法检测在体内DCreg对CD8+T细胞的抑制作用。6. Griess试剂盒检测培养上清中的NO含量。结果1.建立了稳定的LSCs与mDCs共培养体系,并诱导DCreg生成。2. LSCs诱导的DCreg在体内、体外能够抑制抗原特异性CD8+T细胞增殖。体内、体外实验均按以下处理分为4组：CD8+T对照组、mDCs+CD8+T组、DCreg+CD8+T组、mDCs+CD8+T+DCreg组。体外培养72小时后结果显示DCreg能够抑制由mDCs诱导的抗原特异性CD8+T细胞增殖,但DCreg不影响抗原特异性CD8+T细胞活化,表达早期活化标志CD25和CD69,也不影响CD8+T细胞分泌IL-2和IFN-丫。体内实验结果同样如此。3. DCreg与mDCs和CD8+T细胞共培养时,IL-10分泌明显增加,但阻断IL-10后,并未逆转DCreg对抗原特异性CD8+T细胞抑制作用。4.经LPS刺激后的DCreg高分泌NO。在mDCs+CD8+T+DCreg培养体系中,通过阻断上清中NO, DCreg对抗原特异性CD8+T细胞抑制作用发生逆转,提示NO在DCreg对抗原特异性CD8+T细胞抑制作用中起关键作用。结论(1) LSCs表达多种细胞因子和趋化因子。(2) LSCs能使mDCs继续增殖,并分化为具有免疫负向调节作用的DCreg。(3) LSCs诱导产生的DCreg能够抑制抗原特异性CD8+T细胞增殖,但并不影响CD8+T细胞的活化,NO在抑制作用中发挥了关键作用。(4) LSCs诱导产生的DCreg通过体内回输可以在体内抑制抗原特异性CD8+T细胞增殖。意义本实验表明肝脏基质微环境能够促进mDCs分化成DCreg,其对抗原特异性CD8+T细胞的增殖有抑制作用,这种抑制作用主要通过NO介导的。研究有助于深刻理解肝脏免疫微环境及肝脏内免疫细胞亚群在肝脏耐受和维持免疫平衡中的作用。