死亡时间(postmortem interval，PMI)又称死后时间间隔，指发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔。死亡时间推断一直是困扰国内外法医病理学家的重要问题之一。在刑事案件侦查中，准确推断死亡时间对于犯罪现场重建、区分自杀与他杀、缩小侦查范围等有着举足轻重的作用。同时，随着社会法制化的逐步完善，它对于一些保险理赔、医疗纠纷等民事案件也具有一定的现实意义。 以往学者对死后72小时内早期死亡时间推断进行了大量研究，并已建立了一些行之有效的方法。然而，实际工作中有时会碰到腐败尸体死亡时间推断的棘手问题。近年来，一些学者根据组织DNA、mRNA和蛋白的降解、尸体化学和腐败气体气压的变化、嗜尸性昆虫及腐败细菌的活动等规律对腐败尸体死亡时间推断做了有益的尝试，但受检材腐败和技术等限制而未能有效应用于实践，目前仍主要是根据办案人员的经验进行推断。因此，建立一种简便有效的用于腐败尸体死亡时间推断的方法，在刑事科学技术中具有重要的理论和应用价值。 DNA是生物体组织细胞内重要的遗传物质，同一物种组织细胞核DNA平均含量基本一致。研究表明：机体在死后一段时间内，其组织细胞核DNA发生规律性降解，检测其含量变化对死亡时间推断具有重要意义。肋软骨组织内无血管、淋巴管等细菌繁殖所需的营养成分，软骨基质由大量Ⅱ型胶原等成分交织成牢固的三维网状结构，软骨细胞位于软骨陷窝内、受外界环境条件影响较小，故死后软骨细胞降解较为缓慢，且其取材方便，有望用于腐败尸体死亡时间推断。 本课题基于腐败发生的本质，选取易获取且腐败较缓慢的肋软骨作为研究对象，借助常规HE、Feulgen、AgNOR等组织形态学方法和PCR相对半定量技术，研究下列问题： (1)观察不同腐败时期肋软骨细胞核DNA含量变化，推断其与腐败尸体死亡时间之间的关系； (2)观察不同腐败时期肋软骨组织形态学变化、肋间肌内腐败细菌变化规律，探讨其在腐败尸体死亡时间推断中的参考价值。材料和方法30只健康雌性SD大鼠(购自中山大学动物实验中心)，体重190～200g，随机分为10组，每组3只大鼠，断颈处死后，取其中一组作为对照组并即刻解剖。其余9组置于21±1℃恒温光照培养箱内，分别于死后1d、3d、5d、1w、2w、3w、4w、5w、6w时间点选取一组大鼠，观察记录其尸体腐败现象，并于相对固定部位提取双侧肋软骨及肋间肌(6w组肋软骨及肋问肌完全消失)。从以下两方面进行研究： 1．组织形态学： 标本置于10﹪中性福尔马林溶液中固定48h，流水冲洗后常规脱水、包埋、切片，分别行HE和改良Feulgen染色显示细胞及胞核形态、ABNOR染色显示腐败细菌，并以目标面积(A)、积分灰度(IG)、平均灰度(AG)为分析指标，对肋软骨细胞核Feulgen染色结果进行计算机图像分析。 2．分子生物学： 部分肋软骨取材后立即置于-70℃超低温冰箱冻存，酚-氯仿法提取其DNA，分别进行GAPDH、β-actin引物的PCR扩增，借助MICRO-COSMOS图像分析软件，以平均灰度(AG)为分析指标对肋软骨细胞DNA进行相对半定量分析。 结果 1．HE染色结果：软骨组织于死后1d无明显变化；死后3d，软骨细胞开始皱缩，细胞核固缩浓染；死后5d，软骨细胞胞质呈弱嗜酸性染色，核仁消失；死后1w，软骨细胞肿胀、呈不规则网状，胞质嗜酸性增强，部分细胞核溶解；死后2w，软骨膜完全消失，软骨细胞皱缩、结构不清、呈嗜酸性变，偶见残存细胞核；死后3w，软骨基质完全嗜酸性变；死后4w，软骨细胞边缘模糊，形态不规则，细胞核完全消失；死后5w，软骨组织仅残留部分网状结构。 2．改良Feulgen染色结果： 死后1～3d，细胞核开始固缩浓染、轮廓清晰、结构完整；3d后，细胞核数量逐渐减少，至4w时完全崩解；细胞核着色则逐渐变浅淡，至3w时着淡红色；死后1w，细胞核边缘开始变模糊或呈毛刺状，形态尚规则；死后2w，细胞核形态不规则、边缘模糊；死后3w，仅残存少量轮廓不清的细胞核；死后4w，细胞核完全崩解为大小不一的DNA碎片；死后5w，仅残存网状结构。 3．PCR半定量结果： 一定质量肋软骨组织内核DNA含量在对照组最高，随PMI延长其含量逐渐降低：GAPDH和β-actin基因扩增产物电泳条带于死后1w内亮度较高，1w后亮度明显开始降低。对各电泳条带灰度值进行相对半定量分析显示：GAPDH和β—actin基因扩增产物在死后1w内较稳定，1w后随PMI延长，基因扩增产物总体呈下降趋势。 4．AgNOR染色结果： 肋间肌组织于死后3d开始出现被染成金黄色的短杆状细菌；死后3d～1w，杆状细菌逐渐增多、增长变粗，以浸润实质为主；死后2w、3w，组织内杆状细菌数量逐渐减少、形态变细长，以浸润间质为主；死后4w，细菌数量增多，杆状菌与球状菌共存，以浸润实质为主；死后5w，组织内主要为散在分布的球状菌，偶见杆状菌。 5．改良Feuigen法：DNA特异性染色统计学处理结果以死亡时间(PMI)为自变量(X)，分别以目标面积(A)、积分灰度(IG)、平均灰度(AG)为因变量(Y)，应用SPSS13.0统计软件包对图像分析值进行散点图和拟合曲线分析，得到如下线性回归方程： A：Y=136.405-2.331X，R2=0.459(P<0.05)IG：y=13073.928+483.648X，R2=0.581(P<0.05)AG：y=139.157+3.408X，R2=0.613(P<0.05) 综上所述，本研究采用改良Feulgen染色结合图像分析技术及半定量PCR技术研究肋软骨细胞核DNA含量变化，采用常规HE染色和AgNOR染色分别研究肋软骨和肋间肌内细菌形态变化，发现它们均与PMI相关，有望用于腐败尸体死亡时间推断。 1．死后肋软骨细胞核DNA含量随死亡时间延长呈线性下降，可望用于腐败尸体PMI的推断。 2．死后肋软骨各成分的存留时间长短和染色特性转变，可为腐败尸体PMI范围的界定提供参考。 3．死后肋间肌内腐败细菌形态及浸润部位的变化，可为腐败尸体PMI推断提供客观依据。