背景急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种成人最常见的高度异质性的血液恶性肿瘤,其特点是血细胞分化成熟障碍,正常造血受到抑制,而未成熟的血细胞在骨髓或外周血聚集,临床上导致发热、感染、出血、贫血等症状。即使在当前先进的管理及治疗下,AML仍然是一种高复发、高死亡的疾病,总体五年生存率不足50%,老年患者不足20%。随着测序技术的普及推广,新的突变以及表观遗传学和蛋白质组学相关的分子标志物不断被发现,完善了AML患者的风险分层并提供了治疗的靶点。目前,针对FLT3-ITD突变的靶向药物,针对IDH1/2突变的靶向药物,针对BCL2的抑制剂都已面市,为AML的治疗提供了新的方法,并取得良好效果。但是,由于AML异质性很强,这些靶向药物还远远不能满足临床的需要。因此,探寻新的AML分子标志物对于AML的诊断、预后判断、治疗和监测都非常重要。高三尖杉酯碱（HHT）是从海南粗榧碱中提取的生物碱,被美国FDA批准用于慢性髓细胞白血病（CML）的治疗。在国内HHT更是被广泛应用于AML的治疗,我们团队创新性的提出“HAA”方案,通过多中心临床研究,目前在中国成为初治成人AML患者的一线治疗方案。然而,患者接受以HHT为基础的HAA方案,也面临着耐药复发的问题,而HHT的耐药问题尚缺乏研究。我们通过构建HHT耐药细胞株,经高通量测序技术研究HHT耐药细胞株的转录组学改变,分析敏感细胞株与耐药细胞株的差异表达基因,以揭示HHT耐药的机制,并探索新的AML分子标志物。目的通过对9株AML细胞株进行药敏实验,选择HHT敏感的细胞株作为实验细胞株,采用从低浓度到高浓度逐渐增加HHT浓度诱导培养建立不同HHT耐药指数的AML细胞株。比较HHT耐药细胞和敏感细胞的分子生物学改变。通过二代高通量RNA-sequence比较HHT敏感细胞株及HHT不同耐药指数的耐药细胞株的转录组学改变,通过生物信息学的分析,揭示HHT耐药的可能机制。进一步利用公共大数据结合HHT耐药后的差异表达基因,筛选出对AML具有预后和/或治疗意义的新的分子标志物,并通过本中心的AML样本库进一步验证新发现的分子标志物对AML的预后意义。探索新发现的分子标志物对AML的调控作用及调控机制,完善AML的预后分层体系,为AML的靶向药物的筛选提供新靶点,为AML的个体化治疗提供实验依据。方法1.利用MTS方法检测HHT对9株AML细胞株THP-1、KG-1、U937、MOLM13、MV4-11、HL-60、Kasumi-1a、OCI-AML3、NB4的IC50值。选择对HHT最敏感的细胞株MV4-11和MOLM13进行HHT耐药诱导。HHT从低浓度开始加入细胞培养基,按等差逐渐增加HHT浓度,当细胞在特定HHT培养环境下可以连续正常生长2周时,提高HHT浓度。利用耐药指数（RI）评判HHT的耐药效果,并冻存不同耐药指数的细胞。当细胞在HHT 50nm/L的培养环境下可以正常稳定生长时停止耐药诱导。选择细胞在10nm/L、30nm/L、50nm/L的培养条件下建立起来的耐药细胞株进行HHT耐药的研究。2.利用流式检测HHT敏感细胞株及耐药细胞株的凋亡,利用MTS方法测定HHT敏感细胞株和HHT耐药细胞株的生长曲线,利用流式检测HHT敏感细胞株和HHT耐药细胞株的细胞周期及细胞表面多药耐药基因p-gp表达改变。利用裸鼠皮下荷瘤模型体内观察HHT耐药效果。3.对HHT敏感细胞株及耐药细胞株进行高通量二代RNA-sequence（RNAseq）,通过对RNA-seq的分析,比较HHT敏感细胞株及不同耐药指数细胞株的转录组数据变化,并通过q RT-PCR对RNA-seq结果进行验证。进一步通过对差异表达基因进行GO富集分析以及Hub gene的筛选,分析HHT耐药的相关调控通路及主要的调控基因,并进行初步验证。4.利用在线公共数据库UALCAN和GEPIA对HHT敏感细胞株与HHT耐药细胞株显著差异表达基因（DEGs）进行AML的预后分析。选择满足以下情况的DEGs进行下一步的研究:（1）在AML中具有癌基因的作用;（2）该基因表达高低的AML预后具有明显的统计学差异,其P值应小于0.001;（3）该基因在AML中的意义尚未见报道。我们对具备以上三种情况的DEGs进行研究,研究其在AML中的表达、预后意义及调控机制。5.选择一个差异高表达基因和一个差异低表达基因进行研究。利用本中心AML样本库,通过q RT-PCR分析差异表达基因在AML的表达水平,并结合患者的年龄、性别、白细胞数、红细胞数、血红蛋白量、血小板数、骨髓原始细胞比例、染色体核型、基因突变类型、治疗方案、治疗效果以及生存时间等临床资料,分析差异表达基因在AML中的表达特点,包括不同基因表达水平AML患者的治疗反应、总体生存时间（OS）、无事件生存时间（EFS）和无复发生存时间（RFS）。通过多因素回归分析分析DEGs对AML患者的独立预后意义。6.利用小发卡RNA（sh RNA）靶向敲减技术,在AML细胞中敲减差异表达基因,通过流式细胞仪检测GFP表达,应用q RT-PCR及蛋白印迹（Western Blot,WB）对敲减效果进行验证。观察DEGs在AML细胞敲减后对细胞的生长、凋亡、周期、表面抗原改变等生物学功能的影响。7.利用高通量二代测序分析正常表达差异基因的AML细胞与差异基因敲减细胞的RNA-seq,结合TCGA数据库AML患者RNA-seq数据,分析差异表达基因对AML调控作用的分子机制并通过蛋白印迹（Western Blot,WB）进行验证。8.利用AML动物模型研究差异表达基因在体内对AML的调控作用。将转染和未转染sh RNA的AML细胞经尾静脉注射到免疫缺陷的NCG小鼠体内。通过小鼠外周血CD45表达或活体成像判断AML小鼠模型的建模是否成功,观察并记录小鼠的生存时间,比较不同处理组小鼠的肿瘤负荷、生存时间差异。9.利用auto-dock计算机模型分析HHT与差异表达基因的靶向关系,并利用此技术寻找差异表达基因新的靶向药物,并通过增殖、凋亡实验初步判断靶向药物对AML细胞的毒性作用。结果1.挑选对HHT敏感的AML细胞株:将HHT稀释成不同的浓度,以最低细胞半数致死量（IC50）选择细胞株,结果发现AML细胞株MV4-11和MOLM13对HHT最为敏感,IC50分别为7.207 nmol/L、6.858nmol/L,故选择这两株细胞株作为诱导耐药对象。通过逐渐增加HHT浓度诱导细胞对HHT耐药。结果成功构建了HHT不同耐药指数的MV4-11、MOLM13细胞株,分别命名为MV4-11R10、MV4-11R30、MV4-11R50;MOLM13R10、MOL13R30、MOLM13R50。用HHT50nmol/L浓度培养建立的MV4-11R50和MOLM13R50耐药细胞株对HHT的IC50分别为58.82 nmol/L、109.9 nmol/L,耐药指数（RI）分别为15.81、28.11,呈现高耐药水平。通过流式细胞仪分析耐药细胞株的凋亡情况,结果表明耐药细胞株基本没有凋亡,裸鼠皮下荷瘤建模成功表明这些耐药细胞株也具有体内耐药性和成瘤性,可用于后续的药物筛选研究。2.通过对耐药细胞株的表型分析,发现HHT耐药细胞株生长速度比敏感细胞株慢,存在细胞周期G0/G1期的阻滞与S期的减少,HHT耐药细胞株表面的多药耐药基因p-gp表达水平升高。通过对RNA-seq数据进行分析,我们发现免疫调控相关通路,特别是G蛋白偶联受体介导的免疫信号在HHT的耐药中具有重要作用。G蛋白相关蛋白GNAI1和CALCRL对AML具有预后意义且可能介导对HHT的耐药。通过公共在线数据库UALCAN和GEPIA分析DEGs,我们发现差异低表达的DPYSL2、C10orf128和差异高表达的SPATS2L、MAP4K1基因对AML具有显著的预后意义,其P值均小于0.001,更有意义的是,目前这几个基因在AML中的意义及相关研究均未见报道。3.通过q RT-PCR和Western Blot证实差异低表达基因DPYSL2在不同的HHT耐药细胞中低表达。结合本中心样本库AML患者的数据及TCGA数据库的数据,我们发现DPYASL2在AML患者中的表达水平高于正常健康者且DPYSL2表达随着治疗的缓解而降低。TCGA数据库和本中心数据库均表明DPYSL2高表达AML患者有更短的OS。进一步分析本中心数据,发现高表达DPYSL2 AML患者有更差的EFS和RFS。多因素分析发现DPYSL2高表达是AML患者OS、EFS、RFS的独立预后不良因子。4.通过sh RNA靶向敲减（KD）DPYSL2在AML细胞中的表达可以抑制AML细胞生长,促进AML细胞凋亡。Western Blot发现敲减（KD）DPYSL2可以增加凋亡调控蛋白PARP、caspase3的剪切带,降低磷酸化BCL2的表达,而对总的BCL2表达无影响。小鼠AML模型也证实DPYSL2 KD可以减少AML肿瘤负荷,延长AML小鼠的生存期。5.通过对DPYSL2对照组和DPYSL2 KD组的RNA-seq数据进行分析,发现PI3K-AKT信号通路在DPYSL2 KD细胞中被抑制。通过分析TCGA RNA-seq数据,发现DPYSL2高表达组PI3K/AKT通路及上游的JAK/STAT3/5信号通路活性更强。进一步通过Western Blot证实JAK2/STAT3/STAT5-PI3K/AKT/GSK3b通路是DPYSL2对AML的主要调控通路。Auto-dock计算机对接模拟发现,HHT和双氢青蒿素（DHA）都可以直接靶向DPYSL2,并发挥良好的抗白血病作用。6.通过q RT-PCR和Western Blot证实差异高表达基因SPATS2L在不同的HHT耐药细胞中高表达。通过q RT-PCR发现SPATS2L在血液系统恶行肿瘤中均有表达,且在AML细胞株THP-1及多发性骨髓瘤细胞株MMIS表达最高。荧光共聚焦发现SPATS2L定位在AML细胞的细胞核。结合本中心样本库AML患者的数据及TCGA数据库的数据,发现SPATS2L在急性单核细胞白血病（M5）中的表达水平高于其他类型AML,在中危及高危预后的AML患者中的表达水平高于低危预后的AML患者,并且表达水平随着治疗的缓解而降低。TCGA数据库和本中心数据库均表明SPATS2L高表达AML患者有更短的OS。本中心数据分析还发现高表达SPATS2L的AML患者EFS和RFS更差。多因素分析发现SPATS2L高表达是AML患者OS、EFS和RFS的独立预后不良因子。7.通过sh RNA靶向敲减AML细胞中SPATS2L可抑制AML细胞生长、促进AML细胞凋亡、降低p-gp的表达。Western Blot发现敲减SPATS2L可以增加凋亡调控蛋白PARP和caspase3的剪切带,降低磷酸化BCL2的表达,而对总的BCL2表达无影响。小鼠AML模型也证实SPATS2L KD可以减少AML肿瘤负荷,延长AML小鼠的生存期。8.通过分析SPATS2L对照组和SPATS2L KD组细胞的RNA-seq数据和TCGA数据库RNA-seq数据,发现JAK2/STAT3/STAT5信号通路在SPATS2L敲低后和SPATS2L高表达组被抑制。进一步通过Western Blot检测证实JAK2/STAT3/STAT5信号通路是SPATS2L对AML的主要调控通路。AML细胞SPATSL2表达降低可以促进AML化疗药物的凋亡作用,靶向STAT3/STAT5的抑制剂可以降低SPATS2L在AML细胞中的表达并具有抗白血病作用。结论1、成功构建了HHT不同耐药指数的AML细胞株,HHT耐药细胞株的细胞周期G0/G1期的延迟和S期的减少,细胞表面抗原p-gp表达升高。通过RNA-seq发现G蛋白相关分子GNAI1、CALCRL介导的免疫激活可能是HHT耐药的分子机制。2、DPYSL2在耐药细胞株中是差异低表达的基因,该基因在AML细胞中的表达明显高于正常细胞。3、AML患者高表达DPYSL2预后不良,高表达DPYSL2是AML的独立预后不良分子标志物。4、DPYSL2可以通过JAK2/STAT3/STAT5-PI3K/AKT/GSK3b轴发挥对AML的调控作用。5、通过auto-dock计算机分子对接分析技术,发现HHT和DHA均是DPYSL2的直接靶向药物。6、SPATS2L是差异高表达基因,定位在AML细胞核。7、SPATS2L在AML-M5及中高危AML患者中高表达、且与不良预后相关,是AML新的独立不良预后分子标志物。8、SPATS2L可以通过JAK2/STAT3/STAT5轴发挥对AML的调控作用。本研究中我们构建了HHT耐药细胞株,揭示了HHT耐药的可能机制。以HHT耐药细胞株的DEGs为切入点发现并证明了两个AML新的预后及治疗的分子标志物及对AML作用的可能机制,并探索了其靶向药物,对于AML预后体系的完善及新药研发和AML个体化治疗具有重要意义。