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雄烯酮是由睾丸生成的一种甾体化合物，是引起公猪膻味的化合物之一。它的沉积水平取决于其在猪体内的合成和代谢水平，并由多个基因参与调控。目前的研究发现，CYP11A1、CYP17和StAR是雄烯酮合成的主要基因。而COUP-TFⅠ是与雄烯酮合成和代谢基因有关的转录因子。COUP-TFⅠ已经被证实在小鼠、牛和人肾上腺皮质细胞中是CYP17基因转录的负调控蛋白，同时，它可抑制StAR的表达而抑制载体化合物的形成。但却没有相关的研究表明COUP-TFⅠ与猪睾丸中雄烯酮合成分子机理相关的CYP11A1、CYP17A1、StAR基因之间存在直接的关系。本研究拟使用细胞培养，真核表达载体构建与瞬时转染等方法，利用qRT-PCR、ELISA等分析手段，探究COUP-TFⅠ与猪睾丸中雄烯酮合成途径中CYP11A1、CYP17A1和StAR之间的关系，从而阐明COUP-TFⅠ对雄烯酮合成影响的分子机理，为改善公猪膻味，选育优良公猪提供理论依据。
不同品种及不同月龄阶段的猪睾丸及其睾丸间质细胞的生理功能有所不同。有研究表明，低月龄阶段公猪的雄烯酮水平低于高月龄阶段的雄烯酮水平。本实验选取幼年期1月龄和成年期6月龄的巴马香猪睾丸，主要从两个方面进行了研究:
(1)以β-actin作为内参基因，利用qRT-PCR分析不同月龄阶段中COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1和StAR基因的相对表达量，利用ELISA方法测定睾丸组织中雄烯酮的水平;
(2)利用不过筛培养法对1月龄和6月龄的巴马香猪睾丸间质细胞进行体外培养，构建含有筛选基因neo的COUP-TFⅠ真核表达载体COUP-TFⅠ-neo，并将此重组质粒通过瞬时转染的方法转入1月龄和6月龄的猪睾丸间质细胞，同时以转染pEGFP-C1质粒和未转染的细胞作对照。利用qRT-PCR分析转染后细胞中COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1和StAR的相对表达量的变化，利用ELISA检测转染后细胞中雄烯酮水平的变化。
通过以上实验，得到了如下结果:
(1) COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1和StAR在1月龄和6月龄的睾丸组织中均有表达。6月龄睾丸组织中COUP-TFⅠ、CYP17A1和StAR的相对表达量与1月龄相比，差异极显著(P＜0.01)，而CYP11A1差异显著(P＜0.05)。总体上来看，6月龄睾丸组织中的这四个基因的表达量高于1月龄睾丸组织相应的基因表达量;1月龄和6月龄睾丸组织中雄烯酮含量分别为1.6583+0.0133 ng/mL和3.3812+0.0214 ng/mL。
(2)构建了COUP-TFⅠ-neo重组质粒，并将其转入了1月龄和6月龄的巴马香猪睾丸间质细胞。qRT-PCR结果显示:在转入COUP-TFⅠ-neo重组质粒后，1月龄和6月龄细胞中的CYP11A1、CYP17A1和StAR的相对表达量都出现了降低。并且1月龄和6月龄细胞中CYP11A1、CYP17A1和StAR的相对表达量与相应的空白对照和转染pEGFP-C1的阴性对照组相比，差异都为极显著(P＜0.01)。对比未进行转染和转染COUP-TFⅠ-neo重组质粒后的1月龄和6月龄细胞，6月龄细胞中COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1的相对表达量与1月龄的相比，差异都极显著(P＜0.01)，而StAR的相对表达量差异都显著(P＜0.05);且未进行转染的6月龄细胞中CYP11A1、CYP17A1和StAR的相对表达量高于1月龄细胞，转染COUP-TFⅠ-neo重组质粒后的6月龄细胞中CYP11A1、CYP17Al和StAR的相对表达量低于1月龄细胞。通过ELISA检测发现，转染COUP-TFⅠ-neo重组质粒的6月龄细胞的雄烯酮水平与空白对照和转染pEGFP-C1的阴性对照组相比，差异极显著(P＜0.01);转染COUP-TFⅠ-neo重组质粒的1月龄细胞的雄烯酮水平与空白对照和转染pEGFP-C1的阴性对照组相比，差异显著(P＜0.05)。
根据实验结果，得出了如下结论:
(1) COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1和StAR在1月龄和6月龄的睾丸组织中均有表达，6月龄睾丸组织中这些基因的相对表达量以及雄烯酮水平都高于1月龄的睾丸组织。睾丸组织中CYP11A1、CYP17A1和StAR的表达量与雄烯酮水平正相关;
(2)上调COUP-TFⅠ的表达可以显著抑制CYP11A1、CYP17A1和StAR的表达以及雄烯酮的水平的产生，且COUP-TFⅠ对6月龄细胞中CYP11A1、CYP17A1和StAR基因以及雄烯酮水平的抑制作用明显强于1月龄细胞。