研究背景:胰腺癌是一种进展迅速、临床预后极差的消化道恶性肿瘤,其5年生存率低于2%。近几年,虽然外科手术技术和放化疗方案在不断改进,但胰腺癌患者的治疗效果和临床预后却没有得到明显改善。胰腺癌的主要生物学特性是高侵袭性和高转移性。这也是导致胰腺癌患者预后差的主要原因,因此胰腺癌的侵袭、转移机制备受学者们的关注。胰腺癌的转移是一个多阶段的过程,涉及肿瘤细胞骨架的重排、原发灶脱落、对周围细胞外基质的侵入以及新生血管的再塑。深入研究并揭示胰腺癌转移的相关分子及调控机制,对寻找更为有效的胰腺癌诊断和治疗靶点、提高患者生存质量具有极其重要的意义。Ezrin蛋白又称细胞绒毛蛋白,是一种膜与细胞骨架的连接蛋白,与根蛋白、膜蛋白共同组成ERM蛋白家族(Ezrin/Radixin/Moesin)。Ezrin主要参与细胞的有丝分裂、凋亡、粘附、形态维持以及运动等生物学过程。大量研究显示,Ezrin的异常高表达与食管癌、胃癌、结直肠癌等多种消化道恶性肿瘤的发生发展密切相关。其中,Liang等[1]研究证实,Ezrin高表达与食管癌、胃癌、结直肠癌患者的肿瘤分级、TNM分期、淋巴结转移以及不良预后相关,并且认为Ezrin可以作为诊断胃肠道肿瘤的潜在生物标志物。本课题组的前期研究发现,Ezrin在宫颈癌、乳腺癌的 EMT(Epithelial mesenchymal transition,EMT)进程以及 AKT通路的激活过程中发挥着重要作用,但是否参与胰腺癌演进尚不明确。YAP蛋白又称为Yes相关蛋白,是一种细胞内连接蛋白和转录辅激活因子。作为Hippo信号通路下游的关键转录共激活因子之一,YAP参与调控细胞形态、分化、增殖/凋亡平衡以及接触性抑制等生物学过程。Liu等[2]研究发现,YAP蛋白的高表达与宫颈癌患者的组织学分级、淋巴结转移和复发密切相关。Shao等[3]研究显示,YAP与K-ras共同作用于转录因子FOX的激活,从而促进肺癌的EMT进程。在前期研究中,我们首次揭示Ezrin可通过调控YAP的表达介导皮肤成纤维细胞的形态,促进细胞的增殖,但Ezrin是否会通过YAP影响胰腺癌的生物学行为,尤其是在转移和EMT进程中是否发挥调控作用尚不明确。研究目的:分析胰腺癌组织标本中Ezrin/YAP的表达情况及其与临床病理学参数之间的关系,再通过体内外实验验证Ezrin/YAP在胰腺癌增殖、转移及血管形成过程中的作用及分子机制,阐明Ezrin/YAP在胰腺癌演进过程中是否具有分子标志物作用。材料与方法:1.胰腺癌组织标本及数据库分析:1)通过TCGA、Oncomine数据库检索和分析胰腺癌组织中Ezrin和YAP蛋白的表达情况以及与生存期之间的关系;2)应用免疫组化方法检测Ezrin和YAP蛋白在胰腺癌和癌旁正常组织中的表达情况,并分析其与患者临床病理参数之间的相关性及二者之间的关系;3)利用Kaplan-Meier生存分析评估Ezrin和YAP蛋白的表达对患者临床预后的价值。4)绘制ROC曲线,分析Ezrin和YAP蛋白在胰腺癌诊断中的敏感性、特异性。2.体外实验:1)通过Western blot方法检测Ezrin蛋白在胰腺癌细胞系MiAPaca-2、BxPC-3、ASPC-1、SW1990、Capan-1、Panc-1 中的表达情况,并筛选适宜的细胞系进行下一步实验;2)分别对Capan-1、BxPC-3细胞进行Ezrin沉默及过表达处理,并应用Western blot方法验证Ezrin在细胞中的表达情况;3)应用平板克隆、EdU以及MTT实验检测差异表达Ezrin对胰腺癌细胞增殖能力的影响;4)利用划痕、Transwell和微球体形成实验检测Ezrin差异表达对胰腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响;5)通过Western blot实验检测Ezrin沉默和过表达后EMT相关标记物、基质金属蛋白酶以及血管标志物蛋白(包括上皮标记物E-cadherin、ZO-1 和间质标记物 Vimentin、Snail、Slug、β-Catenin,基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9和血管标志物VEGF)表达水平的变化,并且免疫荧光实验检测以上相关指标的表达;6)Western blot方法检测差异表达Ezrin对p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-S6、S6、p-4EBP1、4EBP-1 通路蛋白的影响;7)微管形成实验、血管生成拟态实验检测Ezrin差异表达对人脐静脉内皮细胞HUVEC形成血管能力和肿瘤细胞的小管形成能力的影响;8)利用核-浆分离法检测Ezrin转染后,细胞核和细胞质中YAP、p-YAP的表达变化;9)应用免疫共沉淀实验检测Ezrin和YAP蛋白的相互作用关系;10)Ezrin过表达后通过Western blot方法检测PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂Rapamycin对相关信号通路蛋白及部分EMT标志物表达的影响,同时检测核内和胞浆内YAP蛋白的表达变化。11)借助平板克隆和Transwell实验检测PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂Rapamycin对过表达Ezrin的BxPC-3细胞增殖、迁移能力的影响。3.体内实验:采用硅胶环作为接种癌细胞的载体,运用假气室法建立胰腺癌鸡胚绒毛尿囊膜模型,以检测沉默和过表达Ezrin对胰腺癌鸡胚绒毛尿囊膜模型血管形成能力的影响。结果:1.Ezrin和YAP在胰腺癌组织中高表达,且均与患者的不良预后密切相关。TCGA、Oncomine数据库结果显示Ezrin和YAP蛋白在胰腺癌组织中呈高表达,且与胰腺癌患者的不良预后密切相关。在108例胰腺癌组织中,Ezrin蛋白的阳性率为86.1%(93/108),显著高于癌旁正常组织的阳性率35.4%(28/79),P<0.001;Ezrin蛋白与胰腺癌患者的病理分级、临床分期、有无淋巴结转移以及神经/脉管浸润密切相关,P<0.05,与患者的性别、年龄、肿瘤部位及肿瘤大小无关,P>0.05;YAP蛋白在胰腺癌组织中高表达,其阳性率为85.2%(92/108),显著高于癌旁正常组织的阳性率31.6%(25/79),P<0.001。YAP蛋白与胰腺癌患者的病理分级、有无淋巴结转移密切相关,P<0.01,与患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤的大小及临床分期无明显相关性,P>0.05;在胰腺癌组织中,Ezrin与YAP蛋白表达呈正相关,r=0.821,P<0.001。生存分析显示,Ezrin和YAP高表达与患者的不良预后相关;单因素分析显示病理分级、淋巴结转移、临床分期、Ezrin和YAP可影响患者的总生存率,而多因素分析结果表明只有Ezrin的表达水平(Wald=6.297,P=0.012)和病理分级(Wald=5.465,P=0.019)是影响患者预后的独立风险因素;ROC曲线显示,在胰腺癌组织中Ezrin和YAP蛋白的AUC值分别为0.782、0.754,提示在临床诊断中具有意义。2.Ezrin高表达促进胰腺癌细胞的增殖。成功构建Capan-1的Ezrin低表达细胞系和BxPC-3的Ezrin高表达细胞系,并通过MTT、平板克隆以及EdU实验发现Ezrin沉默可降低胰腺癌细胞的增殖和克隆形成能力。反之,促进胰腺癌细胞的增殖和克隆形成能力。3.Ezrin通过EMT进程影响胰腺癌细胞的迁移和浸润。通过划痕和Transwell实验发现,沉默Ezrin的表达可抑制胰腺癌细胞的迁移和浸润,而上调Ezrin的表达会促进胰腺癌细胞的迁移和浸润;微球体形成实验进一步证实,沉默Ezrin后胰腺癌细胞刺状突起形成数量明显降低,反之亦然;通过检测差异表达Ezrin后EMT相关标志物的蛋白表达水平发现,高表达Ezrin后,上皮标志物E-cadherin、ZO-1的表达降低,间质标志物Vimentin、β-catenin、Snail、Slug和基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9表达升高,表明Ezrin可通过调控EMT进程影响胰腺癌的迁移和浸润;同时,免疫荧光实验也得到了相同的实验结果。4.Ezrin正性调控胰腺癌的血管形成。通过微管形成实验、血管生成拟态实验发现,沉默Ezrin可有效减弱HUVEC的血管形成能力及胰腺癌细胞的血管生成拟态,而高表达Ezrin则增强其血管形成能力和血管生成拟态。进一步检测差异表达Ezrin后血管标志物VEGF的蛋白表达水平发现,高表达Ezrin后VEGF表达升高,反之表达降低。5.Ezrin高表达抑制YAP的磷酸化,促进YAP的核易位。沉默Ezrin后,胰腺癌细胞中的YAP蛋白无明显改变,而p-YAP表达上调;Ezrin过表达后YAP也无明显变化,而p-YAP表达下调。进一步的核-浆分离实验结果显示,沉默Ezrin后胰腺癌细胞核内YAP蛋白的表达明显下调,胞浆内YAP蛋白表达明显上调。过表达Ezrin,其胞核内YAP表达上调、胞浆内YAP表达下调。在Capan-1和BxPC-3的胞浆中,p-YAP并未随Ezrin的沉默或过表达而发生明显变化。但在胞核中,Ezrin的沉默使p-YAP表达上调,过表达使p-YAP表达下调。免疫共沉淀实验结果进一步证明,Ezrin与YAP蛋白存在相互作用关系。6.Ezrin通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控胰腺癌细胞的EMT进程,并激活YAP使其发生核易位。沉默 Ezrin 可降低 p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、4EBP1蛋白的表达水平。反之,Ezrin高表达时以上各种标志物表达均上调。进一步针对Ezrin高表达的BxPC-3细胞应用PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂Rapamycin后发现,Ezrin过表达对PI3K/AKT/mTOR通路所产生的影响被部分逆转,表明Ezrin可调控PI3K/AKT/mTOR信号通路。同时,在LY294002和Rapamycin的作用下,过表达Ezrin的BxPC-3细胞其核内的YAP蛋白表达下调、胞质内的YAP蛋白表达上调,EMT标志物E-cadherin表达上调、Vimentin表达下调。最后,平板克隆和Transwell实验证实应用LY294002和Rapamycin可以抑制Ezrin过表达BxPC-3细胞的增殖和迁移能力。7)Ezrin高表达促进胰腺癌鸡胚绒毛尿囊膜模型的血管形成。通过建立胰腺癌鸡胚绒毛尿囊膜模型发现,沉默Ezrin可降低胰腺癌细胞对鸡囊胚血管形成能力的影响,反之过表达Ezrin则提高胰腺癌细胞对鸡囊胚血管形成能力的影响。结论:1.Ezrin和YAP在胰腺癌组织中高表达,且均与患者的不良预后密切相关。2.Ezrin高表达可促进胰腺癌细胞的增殖、转移及血管形成。3.Ezrin通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控胰腺癌细胞的EMT进程,并激活YAP使其发生核易位。